線粒體DNA突變與Leber遺傳性視神經(jīng)病變發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、研究背景: Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber's hereditary optic neuropathy，LHON）是一種很常見的遺傳性視神經(jīng)病變，臨床表現(xiàn)主要為雙眼同時(shí)或先后急性或亞急性無痛性視力減退，以中心視野缺失為特征，并且在視力喪失初期常常出現(xiàn)色覺障礙。視力減退可發(fā)生在幾歲到七十多歲的任何年齡段，但多發(fā)于中青年男性。LHON家系的視力損傷呈現(xiàn)出母系遺傳方式，表明了其分子基礎(chǔ)為mtDNA的突變。 該病自19

2、88年Wallace等發(fā)現(xiàn)與mtDNA突變有關(guān)以來，目前已報(bào)道與LHON有關(guān)的突變位點(diǎn)有50多個(gè)。其中，三個(gè)原發(fā)突變ND4 G11778A、ND1G3460A、ND6 T14484C在不同種族人群的LHON家系中占50％以上。與mtDNA突變有關(guān)的LHON具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：不同的mtDNA突變能夠?qū)е禄鞠嗤呐R床表型，不同的臨床表型也可由同一突變所致；而且攜帶有原發(fā)突變的人群中僅50％的男性和10％的女性發(fā)展為視神經(jīng)病變。此外，不同的

3、突變位點(diǎn)表現(xiàn)出的視力減退、發(fā)病年齡以及男女發(fā)病比例不同，即使是在攜帶相同突變位點(diǎn)的家系中以及家系間也是如此。 視力喪失的不完全外顯與mtDNA突變所致的輕微的生物化學(xué)損傷表明了mtDNA突變本身不足以導(dǎo)致臨床表型。因此，其它的修飾因子包括環(huán)境因素、核修飾基因、繼發(fā)突變、線粒體單體型等可能參與了LHON的表型表達(dá)。 研究目的: 1．在全國范圍內(nèi)收集視神經(jīng)病變的家系，建立mtDNA突變頻譜和LHON的資料庫。

4、 2．通過對一個(gè)攜帶有G11778A突變的LHON家系的線粒體全基因組的研究，分析G15497A突變對攜帶G11778A突變的LHON外顯率和表現(xiàn)度的影響 3．進(jìn)一步了解突變位點(diǎn)G15497A對LHON發(fā)病的分子機(jī)制，為臨床尋找更好的治療方案提供幫助 研究對象: 中國各個(gè)地區(qū)的LHON家系；一個(gè)攜帶G11778A突變的LHON家系的先證者及其母系親屬和113例正常對照。 研究方法: 1．通過與溫州

5、眼視光醫(yī)院，北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院和福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院以及另外的一些地方醫(yī)院和科研單位合作建立了家系資料收集的網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院倫理道德委員會(huì)及辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心委員會(huì)許可，病人及所有受試者同意，簽署知情同意書，采集血樣，了解家系情況，并建好數(shù)據(jù)庫。 2．對試驗(yàn)對象進(jìn)行眼科臨床檢查；對采集的血樣提取基因組DNA，并設(shè)計(jì)包含三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)的三對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和測序。 3．對其中一個(gè)攜帶G11778A突變

6、的LHON家系的母系成員進(jìn)行眼科臨床檢查，詳細(xì)詢問并記錄家族疾病史。 4．利用該家系先證者以及113個(gè)正常對照者的基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)包含mtDNA全序的24對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化和測序。 5．使用各種生物軟件（DNAStar、Chromas、Clustal X）分析測序結(jié)果，分析所有的多態(tài)性位點(diǎn)、突變位點(diǎn)以及其保守性，分析mtDNA Cytb G15497A突變對LHON外顯率和表現(xiàn)度的影響。 研究結(jié)果

7、: 1．截至2008年底，本課題組共收集了690個(gè)視神經(jīng)病變的家系，檢測出LHON三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)的家系共302個(gè)。其中，攜帶G11778A、T14484C和G3460A突變的家系數(shù)分別為255、38和9個(gè)。 2．其中一個(gè)家系表現(xiàn)出典型的LHON癥狀，母系成員共26位，其中14位出現(xiàn)不同程度的視力損傷，并且女性發(fā)病率為63％而男性發(fā)病率只有40％；發(fā)病年齡在6歲～28歲之間，平均發(fā)病年齡為17．7歲。 3．對該家系進(jìn)

8、行mtDNA全序列測序分析發(fā)現(xiàn)其攜帶原發(fā)突變G11778A突變以及另外39個(gè)堿基突變，mtDNA屬于東亞單體型G1。在這所有的突變中我們發(fā)現(xiàn)了很有意義的Cytb亞基上高度保守的G15497A突變。 4．在113個(gè)正常對照中均未發(fā)現(xiàn)G15497A突變。 結(jié)論: 1．在中國人群中存在三個(gè)原發(fā)位點(diǎn)突變，并且可使攜帶者發(fā)病，但并不是每個(gè)攜帶者出現(xiàn)LHON癥狀。在中國人群中，G3460A突變的頻率明顯低于白種人，T1448

9、4C突變頻率和白種人接近，但是G11778A突變頻率則明顯高于白種人。 2．該家系具有典型的臨床癥狀，外顯率特別高，G11778A突變是其主要致病因素。 3．G15497A突變使Cytb亞基上第251位高度保守的甘氨酸變?yōu)榻z氨酸，并且已有研究證實(shí)該位點(diǎn)突變與肥胖癥和運(yùn)動(dòng)不耐受有關(guān)。本研究在正常對照組中未發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)，該家系的外顯率高，女性發(fā)病率高于男性，這些表明G15497A突變很可能對原發(fā)突變G11778A起協(xié)同作用