亞硒酸鈉聯(lián)合化療藥物治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。傳統(tǒng)的手術(shù)切除并沒(méi)有帶來(lái)滿意的生存率,絕大多數(shù)病人仍難免死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。化療在腫瘤治療中的地位已經(jīng)明確并肯定,但現(xiàn)有的化學(xué)治療的效果往往令人難以滿意。乳腺癌本身的生物學(xué)過(guò)程歸根結(jié)底是基因變化產(chǎn)生的,其發(fā)生、發(fā)展與多種癌基因過(guò)渡表達(dá),以及腫瘤基因失活密切相關(guān)。因此,研究新的具有高度選擇性的針對(duì)基因靶向的乳腺癌治療是有效控制乳腺癌的迫切需要。硒(selenium,Se)是機(jī)體生理活動(dòng)

2、所必需的微量元素,早在三十年前就有學(xué)者把癌的風(fēng)險(xiǎn)和硒元素聯(lián)系在一起,但直到最近,Combs GF Jr經(jīng)過(guò)多年的研究,認(rèn)為硒元素是一種新型的、具有抗癌活性的、重要的微量元素,同時(shí)美國(guó)的NPC(The nutritional Prevention of Cancer)也通過(guò)大規(guī)模的臨床研究,進(jìn)一步證實(shí)了硒元素的抗癌活性。硒元素的抗癌活性是通過(guò)硒與蛋白質(zhì)相關(guān)結(jié)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。硒結(jié)合蛋白1(Seleium Binding Protein 1 S

3、BP1)是硒結(jié)合蛋白質(zhì)的一種,編碼基因位于1q21-22,分子量為56KD,其mRNA序列(Gene bank座位號(hào):NM-003944)是由1721個(gè)核苷酸組成編碼640個(gè)氨基酸,研究表明硒元素的預(yù)防及抗癌作用是通過(guò)SBP1介導(dǎo)的。硒元素靶向激活SBP1基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抗癌作用。有研究表明,硒抑制腫瘤的作用與硒的制劑形式有關(guān),實(shí)驗(yàn)表明亞硒酸鈉的抑癌作用最強(qiáng)。
　　目的:通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物裸鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討SBP1的誘導(dǎo)劑亞

4、硒酸鈉(Na2SeO3)與常用的化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Florouracil,5-Fu)聯(lián)合應(yīng)用治療乳腺癌的效果,并與單獨(dú)使用Na2SeO3或5-Fu比較,分析亞硒酸鈉與化療藥物臨床聯(lián)合抗腫瘤的可行性和有效性及可能的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.體外培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞,隨機(jī)分為4組:I:對(duì)照組(NS)、II:5-Fu組、III:Na2SeO3組和IV:5-Fu+Na2SeO3組,每組4-6個(gè)樣品。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)

5、結(jié)合我室前期工作證實(shí),5-Fu:10ug/ml;Na2SeO3:8umol/L及兩藥聯(lián)合應(yīng)用48h均能明顯抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞存活率力,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們選取其藥物劑量作為實(shí)驗(yàn)的處理濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用MTT實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;通過(guò)Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化;利用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　2.體內(nèi)構(gòu)建乳腺癌MCF-7荷瘤裸鼠模型,對(duì)接種腫瘤細(xì)胞后的裸

6、鼠進(jìn)行一般生長(zhǎng)情況的觀察。待腫瘤直徑長(zhǎng)至0.5cm后,隨機(jī)分成4組:I:對(duì)照組(NS)、II:5-Fu組、III:Na2SeO3組和IV:5-Fu+Na2SeO3組,每組6只,并開(kāi)始給藥治療,I組:對(duì)照組,注射生理鹽水(NS);Ⅱ組:注射5-Fu(15mg/kg);Ⅲ組:Na2SeO3(6mg/kg);Ⅳ組:5-Fu(15mg/kg)+Na2SeO3(6mg/kg)聯(lián)合注射;以上均采用腹腔注射的方法給藥,觀察裸鼠一般生長(zhǎng)情況和體重變化、

7、計(jì)算瘤體積繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線,待治療結(jié)束后摘取瘤體稱(chēng)瘤重并計(jì)算抑瘤率。
　　3.待治療結(jié)束后分別處死各組裸鼠,取組織臟器進(jìn)行固定常規(guī)脫水石蠟包埋切片染色,對(duì)腫瘤組織及重要臟器,進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)HE染色觀察;
　　4.取切好保存的瘤組織石蠟切片,按常規(guī)脫蠟至水,然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行檢測(cè)相關(guān)凋亡因子caspase-3、Bcl-2的表達(dá)變化情況。
　　5.利用Western blot技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組瘤組織相關(guān)凋亡

8、蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)含量。
　　研究結(jié)果:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5-Fu和Na2SeO3均能抑制MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng),5-Fu與Na2SeO3聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用更為有效,細(xì)胞的存活率明顯降低,表明5-FU與Na2SeO3聯(lián)合用藥能起到對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制效果,有協(xié)同抑制作用。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,接種MCF-7乳腺癌細(xì)胞一周后,裸鼠腋窩區(qū)出現(xiàn)皮下瘤結(jié)節(jié)。裸鼠成瘤達(dá)0.5cm

9、后開(kāi)始給藥治療,觀察荷瘤小鼠一般生長(zhǎng)情況和體重的變化、計(jì)算瘤體積繪制生長(zhǎng)曲線,待治療結(jié)束后摘取瘤體稱(chēng)瘤重并計(jì)算抑瘤率。各組抑瘤率分別為:
　?、窠M:(0.469±0.072--);
　　Ⅱ組:(0.204±0.02556.44％);
　?、蠼M:(0.244±0.01348.05%);
　?、艚M:(0.170±0.02163.74%)。
　　觀察所有的裸鼠皮下移植瘤為圓形、橢圓形或不規(guī)則的結(jié)節(jié)狀,活動(dòng)度差。實(shí)

10、驗(yàn)結(jié)束后,取材進(jìn)行固定常規(guī)脫水石蠟包埋切片,行HE染色形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示,所有皮下成瘤的組織中,細(xì)胞呈異型性改變,細(xì)胞大小不等,大部分生長(zhǎng)活躍并可見(jiàn)核分裂相,重要臟器尚未出現(xiàn)明顯異常形態(tài)改變。
　　3.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,所有呈陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞均呈棕黃色或棕褐色,Caspase-3主要表達(dá)在癌細(xì)胞的胞核,胞漿呈弱陽(yáng)性。聯(lián)合用藥組Caspase-3表達(dá)的平均光密度值明顯強(qiáng)于其余三組,差異有顯著性;NS組Caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度

11、明顯弱于其余三組,差異有顯著性;但5-Fu與Na2SeO3兩組之間沒(méi)有顯著差異。Bcl-2陽(yáng)性物質(zhì)主要表達(dá)在胞漿和核膜,胞核呈弱陽(yáng)性表達(dá),聯(lián)合用藥組表達(dá)的平均光密度明顯弱于其余三組,差異有顯著性;NS組Bcl-2的表達(dá)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于于其余三組,差異有顯著性;Na2SeO3與5-Fu之間沒(méi)有顯著差異。
　　4.Western blot檢測(cè)顯示,聯(lián)合用藥組Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)量高于其余三組,差異有顯著性;NS組的表達(dá)量明

12、顯少于其余三組,差異有顯著性;Na2SeO3與5-Fu之間沒(méi)有顯著差異。聯(lián)合用藥組Bcl-2的蛋白表達(dá)量低于其余三組,差異有顯著性;NS組的表達(dá)量明顯高于其余三組,差異有顯著性;Na2SeO3與5-Fu之間沒(méi)有顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1.Na2SeO3、5-Fu可在體外殺傷MCF-7細(xì)胞,聯(lián)合給藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,可以產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用。聯(lián)合給藥可以產(chǎn)生較為明顯的凋亡細(xì)胞形態(tài)。
　　2.應(yīng)用MCF-7細(xì)胞可成功建立乳腺

13、癌裸鼠移植瘤動(dòng)物模型,將為研究人乳腺癌治療的實(shí)驗(yàn)研究提供可參考的研究工具。
　　3.Na2SeO3與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用起到對(duì)乳腺癌細(xì)胞的聯(lián)合抑制作用,這種抑制作用和凋亡調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)。是通過(guò)增強(qiáng)Caspase-3和Bax的表達(dá),抑制Bcl-2的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用。
　　4.聯(lián)合用藥治療具有較滿意的體內(nèi)抑瘤作用,表現(xiàn)為腫瘤生長(zhǎng)抑制,并可誘導(dǎo)裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　5.亞硒酸鈉與氟尿嘧啶聯(lián)合使用可能有效降低化療藥物的毒副作用。