亞硒酸鈉聯(lián)合化療藥物治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。傳統(tǒng)的手術(shù)切除并沒有帶來滿意的生存率,絕大多數(shù)病人仍難免死于腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移?；熢谀[瘤治療中的地位已經(jīng)明確并肯定,但現(xiàn)有的化學(xué)治療的效果往往令人難以滿意。乳腺癌本身的生物學(xué)過程歸根結(jié)底是基因變化產(chǎn)生的,其發(fā)生、發(fā)展與多種癌基因過渡表達(dá),以及腫瘤基因失活密切相關(guān)。因此,研究新的具有高度選擇性的針對基因靶向的乳腺癌治療是有效控制乳腺癌的迫切需要。硒(selenium,Se)是機(jī)體生理活動

2、所必需的微量元素,早在三十年前就有學(xué)者把癌的風(fēng)險和硒元素聯(lián)系在一起,但直到最近,Combs GF Jr經(jīng)過多年的研究,認(rèn)為硒元素是一種新型的、具有抗癌活性的、重要的微量元素,同時美國的NPC(The nutritional Prevention of Cancer)也通過大規(guī)模的臨床研究,進(jìn)一步證實(shí)了硒元素的抗癌活性。硒元素的抗癌活性是通過硒與蛋白質(zhì)相關(guān)結(jié)合物來實(shí)現(xiàn)的。硒結(jié)合蛋白1(Seleium Binding Protein 1 S

3、BP1)是硒結(jié)合蛋白質(zhì)的一種,編碼基因位于1q21-22,分子量為56KD,其mRNA序列(Gene bank座位號:NM-003944)是由1721個核苷酸組成編碼640個氨基酸,研究表明硒元素的預(yù)防及抗癌作用是通過SBP1介導(dǎo)的。硒元素靶向激活SBP1基因的表達(dá)來發(fā)揮其抗癌作用。有研究表明,硒抑制腫瘤的作用與硒的制劑形式有關(guān),實(shí)驗(yàn)表明亞硒酸鈉的抑癌作用最強(qiáng)。
　　目的:通過體外實(shí)驗(yàn)和動物裸鼠模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討SBP1的誘導(dǎo)劑亞

4、硒酸鈉(Na2SeO3)與常用的化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Florouracil,5-Fu)聯(lián)合應(yīng)用治療乳腺癌的效果,并與單獨(dú)使用Na2SeO3或5-Fu比較,分析亞硒酸鈉與化療藥物臨床聯(lián)合抗腫瘤的可行性和有效性及可能的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.體外培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞,隨機(jī)分為4組:I:對照組(NS)、II:5-Fu組、III:Na2SeO3組和IV:5-Fu+Na2SeO3組,每組4-6個樣品。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)

5、結(jié)合我室前期工作證實(shí),5-Fu:10ug/ml;Na2SeO3:8umol/L及兩藥聯(lián)合應(yīng)用48h均能明顯抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞存活率力,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們選取其藥物劑量作為實(shí)驗(yàn)的處理濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用MTT實(shí)驗(yàn)法檢測腫瘤細(xì)胞的生長情況;通過Hoechst 33258染色觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化;利用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。
　　2.體內(nèi)構(gòu)建乳腺癌MCF-7荷瘤裸鼠模型,對接種腫瘤細(xì)胞后的裸

6、鼠進(jìn)行一般生長情況的觀察。待腫瘤直徑長至0.5cm后,隨機(jī)分成4組:I:對照組(NS)、II:5-Fu組、III:Na2SeO3組和IV:5-Fu+Na2SeO3組,每組6只,并開始給藥治療,I組:對照組,注射生理鹽水(NS);Ⅱ組:注射5-Fu(15mg/kg);Ⅲ組:Na2SeO3(6mg/kg);Ⅳ組:5-Fu(15mg/kg)+Na2SeO3(6mg/kg)聯(lián)合注射;以上均采用腹腔注射的方法給藥,觀察裸鼠一般生長情況和體重變化、

7、計(jì)算瘤體積繪制腫瘤的生長曲線,待治療結(jié)束后摘取瘤體稱瘤重并計(jì)算抑瘤率。
　　3.待治療結(jié)束后分別處死各組裸鼠,取組織臟器進(jìn)行固定常規(guī)脫水石蠟包埋切片染色,對腫瘤組織及重要臟器,進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)HE染色觀察;
　　4.取切好保存的瘤組織石蠟切片,按常規(guī)脫蠟至水,然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行檢測相關(guān)凋亡因子caspase-3、Bcl-2的表達(dá)變化情況。
　　5.利用Western blot技術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)各組瘤組織相關(guān)凋亡

8、蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)含量。
　　研究結(jié)果:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5-Fu和Na2SeO3均能抑制MCF-7細(xì)胞的生長,5-Fu與Na2SeO3聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用更為有效,細(xì)胞的存活率明顯降低,表明5-FU與Na2SeO3聯(lián)合用藥能起到對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制效果,有協(xié)同抑制作用。
　　2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,接種MCF-7乳腺癌細(xì)胞一周后,裸鼠腋窩區(qū)出現(xiàn)皮下瘤結(jié)節(jié)。裸鼠成瘤達(dá)0.5cm

9、后開始給藥治療,觀察荷瘤小鼠一般生長情況和體重的變化、計(jì)算瘤體積繪制生長曲線,待治療結(jié)束后摘取瘤體稱瘤重并計(jì)算抑瘤率。各組抑瘤率分別為:
　?、窠M:(0.469±0.072--);
　?、蚪M:(0.204±0.02556.44％);
　?、蠼M:(0.244±0.01348.05%);
　?、艚M:(0.170±0.02163.74%)。
　　觀察所有的裸鼠皮下移植瘤為圓形、橢圓形或不規(guī)則的結(jié)節(jié)狀,活動度差。實(shí)

10、驗(yàn)結(jié)束后,取材進(jìn)行固定常規(guī)脫水石蠟包埋切片,行HE染色形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示,所有皮下成瘤的組織中,細(xì)胞呈異型性改變,細(xì)胞大小不等,大部分生長活躍并可見核分裂相,重要臟器尚未出現(xiàn)明顯異常形態(tài)改變。
　　3.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,所有呈陽性反應(yīng)的細(xì)胞均呈棕黃色或棕褐色,Caspase-3主要表達(dá)在癌細(xì)胞的胞核,胞漿呈弱陽性。聯(lián)合用藥組Caspase-3表達(dá)的平均光密度值明顯強(qiáng)于其余三組,差異有顯著性;NS組Caspase-3的表達(dá)強(qiáng)度

11、明顯弱于其余三組,差異有顯著性;但5-Fu與Na2SeO3兩組之間沒有顯著差異。Bcl-2陽性物質(zhì)主要表達(dá)在胞漿和核膜,胞核呈弱陽性表達(dá),聯(lián)合用藥組表達(dá)的平均光密度明顯弱于其余三組,差異有顯著性;NS組Bcl-2的表達(dá)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于于其余三組,差異有顯著性;Na2SeO3與5-Fu之間沒有顯著差異。
　　4.Western blot檢測顯示,聯(lián)合用藥組Caspase-3和Bax的蛋白表達(dá)量高于其余三組,差異有顯著性;NS組的表達(dá)量明

12、顯少于其余三組,差異有顯著性;Na2SeO3與5-Fu之間沒有顯著差異。聯(lián)合用藥組Bcl-2的蛋白表達(dá)量低于其余三組,差異有顯著性;NS組的表達(dá)量明顯高于其余三組,差異有顯著性;Na2SeO3與5-Fu之間沒有顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1.Na2SeO3、5-Fu可在體外殺傷MCF-7細(xì)胞,聯(lián)合給藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,可以產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用。聯(lián)合給藥可以產(chǎn)生較為明顯的凋亡細(xì)胞形態(tài)。
　　2.應(yīng)用MCF-7細(xì)胞可成功建立乳腺

13、癌裸鼠移植瘤動物模型,將為研究人乳腺癌治療的實(shí)驗(yàn)研究提供可參考的研究工具。
　　3.Na2SeO3與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用起到對乳腺癌細(xì)胞的聯(lián)合抑制作用,這種抑制作用和凋亡調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)。是通過增強(qiáng)Caspase-3和Bax的表達(dá),抑制Bcl-2的表達(dá)來發(fā)揮作用。
　　4.聯(lián)合用藥治療具有較滿意的體內(nèi)抑瘤作用,表現(xiàn)為腫瘤生長抑制,并可誘導(dǎo)裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　5.亞硒酸鈉與氟尿嘧啶聯(lián)合使用可能有效降低化療藥物的毒副作用。