放療和DSF聯(lián)合治療乳腺癌的研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國乳腺癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7％~10%，并呈逐年上升趨勢，部分大城市報告乳腺癌已占女性惡性腫瘤之首。乳腺癌是全球女性疾病發(fā)病率和死亡率的主要原因。據(jù)國家癌癥中心和衛(wèi)生部疾病預防控制局2012年公布的2009年乳腺癌發(fā)病數(shù)據(jù)顯示：全國腫瘤登記地區(qū)乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的第1位，女性乳腺癌發(fā)病率（粗率）全國合計為42.55/10萬，城市為51.91/10萬，農(nóng)村為23.12/10萬。乳腺癌的

2、治療進入了綜合治療時代，形成了乳腺癌局部治療與全身治療并重的治療模式。放療主要是清除殘留的乳腺癌細胞，從而達到較好的控制腫瘤生長和提高病人的存活率,但是細胞對輻射的抗輻射性提高了腫瘤的復發(fā)率，又妨礙了放療的抗腫瘤效應(yīng)，也就是說乳腺癌細胞對IR產(chǎn)生了耐受，這樣就影響了IR的抗腫瘤效應(yīng)，腫瘤易復發(fā)。乳腺癌細胞對IR的這種抗輻射性，可能是因為乳腺癌干細胞（Breast cancer stem cells，BCSCs)的存在。已有文獻證實，乳腺

3、癌干細胞具有抗輻射性。已經(jīng)有文獻研究認為，IR可誘導非乳腺癌干細胞（即正常乳腺上皮細胞）轉(zhuǎn)換為乳腺癌干細胞（以下講述將乳腺癌干細胞成為BCSCs）。而這種細胞的轉(zhuǎn)換可能與干細胞基因（c-myc、SOX9，OCT4和KLF4等）的表達有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)該基因通過逆轉(zhuǎn)錄傳導，可重新編碼為具有多能性的干細胞，這種多能性的干細胞又可分化為不同類型的細胞。這些基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤干細胞生長和自我更新中起到重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子Slug和SOX9在

4、正常和惡性細胞中可共同檢測乳腺干細胞狀態(tài)。此外，癌癥重組轉(zhuǎn)錄因子的過表達與進行性腫瘤和不良預后相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)IR通過干細胞基因的再表達，引導分化型癌細胞轉(zhuǎn)變?yōu)锽CSCs。研究表明：乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase，ALDH）可作為癌干細胞的標記物。在文獻中，人和鼠乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn) ALDH1表達增高，認為這些細胞可能是乳腺癌干細胞；這也是本實驗的研究基礎(chǔ)。雙硫侖（Disulfiram，DSF）是美國FDA批準用

5、于治療酗酒的一種藥物，同時也是一種不可逆的ALDH亞型的抑制劑。許多學者研究發(fā)現(xiàn)，在細胞內(nèi)DSF可轉(zhuǎn)換為二乙基二硫代氨基甲酸酯（diethyldithiocarbamate,deDTC）,兩分子的deDTC可以和一分子的銅（copper，Cu2+）相結(jié)合形成Cu[deDTC]2復合物DSF/Cu；如多學者對DSF/Cu研究發(fā)現(xiàn)，它是一種有效的蛋白體酶抑制劑，可以抑制NF-κB信號通路。NF-κB在細胞因子誘導的基因表達中起關(guān)鍵性的調(diào)控作

6、用，它調(diào)控的基因編碼急性期反應(yīng)蛋白、細胞因子、細胞粘附分子、免疫調(diào)節(jié)分子、病毒瘤基因、生長因子、轉(zhuǎn)錄和生長調(diào)控因子等。通過調(diào)控多種基因的表達，NF-κB參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物進程。NF-κB是調(diào)節(jié)許多基因活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，這些基因包含細胞凋亡，炎癥反應(yīng)和抗輻射性等。NF-κB還可以調(diào)控干細胞基因，例如ERBB2，SOX9，MYC和WNT等的表達。本研究是想通過局部治療和全身治療相結(jié)合的方法來開發(fā)一種新療法

7、，即通過放療和DSF相結(jié)合作為一種新的治療方法來治療乳腺癌。
　　目的：本研究提出以下假設(shè)：DSF/Cu是否在體內(nèi)外的試驗中下調(diào)NF-κB信號傳導通路，是否可以提高病人對化療的敏感性，來消除放療誘導由非乳腺癌干細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槿橄侔└杉毎瑥亩_到治療的效果。
　　方法：⑴人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，MDA-MB-231-luc-D3H1，SUM149，UACC-812細胞和鼠乳腺癌細胞系4T1細胞用含有10%胎牛血清和2

8、mmol/L的L-glutamine的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。這種細胞培養(yǎng)基被稱為完全培養(yǎng)基。正常人乳腺上皮細胞是用MammaryLife Medium Complete Kit培養(yǎng)。所有的細胞都是放在含有5%CO2的37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑵6周齡的NOD/SCID的雌鼠來自Taconic,6周齡的BALB/c的雌鼠來自美國麻省綜合醫(yī)院COX7動物部門。所有的動物實驗都經(jīng)由Insititutional Animal Care和U

9、se Committee的批準。⑶利用Real time PCR檢測HER2、SOX9、MYC和WNT3 mRNA的表達水平；⑷利用Western blot檢測HER2、SOX9、MYC和WNT3蛋白的表達水平；⑸利用熒光素酶報告試驗檢測NF-κB的活性；⑹利用微球體形成實驗檢測乳腺癌干細胞；⑺利用ALDEFLUOR Assay檢測ALDHbright細胞的百分比。⑻用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學處理。所有實驗數(shù)據(jù)結(jié)果用

10、±s表示，以α=0.05為檢驗水準。
　　結(jié)果：⑴ALDEFLUOR Assay的結(jié)果：人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，SUM149和UACC-812細胞在接受分級輻射法（3.75 Gy×5day）處理后，ALDHbright細胞的百分比分別增加了2.4倍，1.4倍和4.6倍。而且發(fā)現(xiàn)ALDHbright細胞的百分比增加是依賴IR劑量的增加而增加的。IR組與對照組相比，ALDHbright細胞百分比的增加是由ALDHbrigh

11、t細胞絕對數(shù)的增加伴隨著50.5%總細胞的減少引起的，這表明IR誘導了新的乳腺癌干細胞。⑵微球體形成實驗的結(jié)果：IR+DMSO和IR+Cu組的微球體數(shù)目與對照組相比明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；⑶動物致瘤性試驗的結(jié)果：IR組的腫瘤大小與對照組相比明顯增大，且差異有統(tǒng)計學意義（P=0.02，p<0.05）；⑷經(jīng)流式細胞儀分選出的ALDHneg細胞，該細胞經(jīng)過IR和不同藥物處理后，采用微球體形成實驗的結(jié)果：IR組的微球體數(shù)目

12、與對照組和IR+DSF組相比明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。⑸ALDEFLUOR Assay的結(jié)果：IR+DSF組與對照組、IR、IR+DMSO和IR+Cu相比，ALDHbright細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF/Cu與對照組、IR、IR+DMSO、IR+DSF和IR+Cu相比，ALDHbright細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；⑹微球體形成實驗的結(jié)果：IR+DSF/C

13、u組的微球體數(shù)目與對照組、IR+DMSO、IR+DSF和IR+Cu組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF組的微球體數(shù)目與對照組、DSF/Cu、IR+DMSO、IR+Cu和IR+DMSO組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；DSF/Cu組的微球體數(shù)目與對照組、IR+DMSO、IR+DSF和IR+Cu組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；⑺動物致瘤性試驗的結(jié)果：IR+DSF/Cu組的腫瘤

14、大小與對照組相比明顯縮小，且差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；⑻經(jīng)流式細胞儀分選出的ALDHneg細胞，該細胞經(jīng)過IR和不同藥物處理后，采用微球體形成實驗的結(jié)果：IR+DSF/Cu組的微球體個數(shù)與對照組、IR和IR+DSF組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。⑼細胞增殖和MTT實驗結(jié)果：而細胞增值和細胞凋亡的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DSF/Cu對正常乳腺上皮細胞（可認為是正常乳腺細胞）的細胞生長抑制率約為10%，而對人乳腺癌細胞M

15、DA-MB-231的細胞生長抑制率約為50%，兩種細胞的生長抑制率相比，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。⑽Western Blotting的結(jié)果：IR+DSF/Cu組與DSF/Cu組相比，cleaved PARP表達增加、p-p38表達增加，p-AKT表達降低；IR+DSF/Cu組與IR+DMSO組相比，cleaved PARP表達增加、p-p38表達增加，p-AKT表達降低。⑾熒光素酶活性實驗的結(jié)果：人乳腺癌細胞中IR+DSF/C

16、u和IR+NF-κBi組的NF-κB相對活性與 IR組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；而且IR+DSF/Cu組的NF-κB相對活性和IR+NF-κBi組的NF-κB相對活性相似。⑿Real-time PCR的結(jié)果：IR組的ERBB2，SOX9和MYC基因表達與對照組相比，明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF/Cu組的ERBB2，SOX9和MYC基因表達與IR、IR+DMSO、IR+ROSi組相比明

17、顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+NF-κBi和IR+p65 siRNA組和IR組相比，ERBB2，SOX9和MYC基因的mRNA表達水平明顯降低；差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；但是IR+ROSi組與IR組相比，ERBB2，SOX9和MYC基因的mRNA表達水平?jīng)]有變化；同時還發(fā)現(xiàn) IR+DSF/Cu+ROSi、IR+NF-κBi+ROSi和IR+p65 siRNA+ROSi組與IR組相比，ERBB2，SOX9和M

18、YC基因的mRNA表達水平明顯降低；差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；⒀Western Blotting的結(jié)果：IR組的HER2，SOX9和c-Myc蛋白的表達與對照組相比明顯增加；IR+DSF/Cu組的HER2，SOX9和c-Myc蛋白的表達與IR、IR+DMSO、IR+ROSi組相比明顯降低；IR+NF-κBi和IR+p65 siRNA組和IR組相比，ERBB2，SOX9和MYC蛋白的表達明顯降低；但是IR+ROSi組與IR組相比

19、，ERBB2，SOX9和MYC基因蛋白的表達沒有變化；同時還發(fā)現(xiàn)IR+DSF/Cu+ROSi、IR+NF-κBi+ROSi和IR+p65 siRNA+ROSi組與IR組相比，ERBB2，SOX9和MYC基因蛋白的表達明顯降低。⒁Real-time PCR結(jié)果顯示，IR組的ERBB2，SOX9和MYC基因表達與對照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF/Cu組的ERBB2，SOX9和MYC基因表達與IR、IR+D

20、MSO、IR+ROSi組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。⒂Western Blotting的結(jié)果顯示，IR組的SOX9和c-Myc蛋白的表達與對照組相比明顯增加；IR+DSF/Cu組的SOX9和c-Myc蛋白的表達與 IR、IR+DMSO、IR+ROSi組相比明顯降低。⒃Real-time PCR結(jié)果顯示：在小鼠動物模型中收集的腫瘤組織，Real-time PCR結(jié)果顯示，在第15天時，IR組的ERBB2，SOX9，M

21、YC和WNT3基因的表達與對照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；而 IR+DSF組的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表達與IR相比降低了4.13—6.25倍，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；DSF組的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表達與對照相比降低了1.88—6.24倍，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；。在第29天時，IR組的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表達與對照組相比

22、明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF組的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表達與IR相比降低了1.92—5.25倍，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；DSF組的ERBB2，SOX9，MYC和WNT3基因的表達與對照相比降低了0—2.73倍，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。⒄IHC的結(jié)果：，IR組的Neu，SOX9和c-myc的表達與對照組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF

23、組的Neu，SOX9、c-myc和WNT3的表達與IR相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。⒅微球體形成實驗結(jié)果表明：在第15天，IR組的微球體數(shù)目與對照組相比明顯增多，大約增加了61.0%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF/Cu組的微球體數(shù)目與 IR相比降低了87.2%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF/Cu組的微球體數(shù)目與對照組和DSF組比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；DS

24、F組的微球體數(shù)目與對照組相比明顯減少，大約減少了60.2%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；DSF組的微球體數(shù)目與IR+DSF組相比明顯減少差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。而在第29天，IR組的微球體數(shù)目與對照組相比明顯增多，大約增加了84.2%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）； IR+DSF/Cu組的微球體數(shù)目與IR相比降低了87.2%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；IR+DSF/Cu組的微球體數(shù)目與對照組和DSF組

25、比明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；DSF組的微球體數(shù)目與對照組相比明顯減少，大約減少了64.8%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；DSF組的微球體數(shù)目與IR+DSF組相比明顯減少差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。⒆同源性小鼠動物模型的結(jié)果：IR組的腫瘤體積與對照組相比，減少了20.1%，差異有統(tǒng)計學（p=0.01，p<0.001）；IR+DSF組的腫瘤體積與IR組相比，約減少了74.2%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.0

26、001）；IR+DSF組的腫瘤體積與DSF組相比，約減少了71.1%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.0001）；IR+DSF組的腫瘤體積與對照組組相比，約減少了79.4%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）。⒇對小鼠腫瘤模型的自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)進行分析發(fā)現(xiàn)（見圖17），IR+DSF組的自發(fā)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的大小與對照組相比，明顯縮小了約89.6%，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.001）；DSF組的自發(fā)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的大小與對照組相比，明顯縮小了約20.4%