同種異體神經(jīng)復(fù)合體橋接修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)觀察.pdf

1、目的：將體外培養(yǎng)提純的胎兔雪旺細(xì)胞種植到經(jīng)化學(xué)處理的脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)段中制成橋接復(fù)合體。然后將橋接復(fù)合體移植到兔缺損的坐骨神經(jīng)上，觀察坐骨神經(jīng)的再生及功能恢復(fù)情況。從而證實(shí)橋接復(fù)合體既能為再生神經(jīng)提供良好的支架作用，又能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)軸突和髓鞘的再生，為臨床修復(fù)神經(jīng)缺損提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)理論。 方法：1、胎兔雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)：取懷孕28天的新西蘭白兔．．處死后迅速取胎兔。在手術(shù)顯微鏡下無(wú)菌條件下取胎兔雙側(cè)坐骨神經(jīng)，盡可能剝除神經(jīng)外膜

2、及束膜后將其剪碎。采用雙酶消化法(trypsin/collagenase)和雙差速貼壁法培養(yǎng)和提純雪旺細(xì)胞，并輔以神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)促進(jìn)雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察雪旺細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并接種進(jìn)行傳代，收集生長(zhǎng)良好的第二代細(xì)胞計(jì)數(shù)并應(yīng)用S-100蛋白免疫組化鑒定。2、去細(xì)胞神經(jīng)橋接體的制備：取成年健康新西蘭白兔，自梨狀肌下緣以遠(yuǎn)切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)，作為同種異體神經(jīng)的來(lái)源。手術(shù)顯微鏡下去除其表面的脂肪組織及部分神經(jīng)外膜，并將其分為

3、每段3厘米。首先4℃蒸餾水中靜置6h，再將神經(jīng)段放入3％Triton X-100(聚氧乙烯辛烷基酚)中靜置12h，然后置蒸餾水中震蕩漂洗6h。如此反復(fù)，Triton X-100共作用時(shí)間為96h。對(duì)萃取的神經(jīng)段行石蠟切片HE染色及掃描電鏡觀察去細(xì)胞的情況。3、種植雪旺細(xì)胞的同種異體神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)觀察：將培養(yǎng)的第二代雪旺細(xì)胞以1×10<'8>/ml的濃度用100μI的微量注射器注入神經(jīng)段內(nèi)，然后將神經(jīng)段迅速移植到兔缺損

4、的一側(cè)坐骨神經(jīng)(實(shí)驗(yàn)組)，對(duì)照組移植未注入雪旺細(xì)胞的去細(xì)胞同種異體神經(jīng)，術(shù)后4周，8周，12周大體觀察兔的足部潰瘍形成及愈合情況。通過(guò)肌電圖、光鏡、電鏡等方法檢測(cè)坐骨神經(jīng)軸突及髓鞘的再生及功能恢復(fù)情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)孛分析。 結(jié)果：1、雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)與觀察：經(jīng)傳代的雪旺細(xì)胞倒置相差顯微鏡下計(jì)數(shù)并觀察細(xì)胞形態(tài)：雪旺細(xì)胞的濃度已達(dá)到1×10<'8>/ml，其典型形態(tài)呈梭形，有突起，多為雙極，偶見(jiàn)三個(gè)細(xì)胞突起。胞核明顯，呈卵圓形。細(xì)胞呈端

5、對(duì)端、肩并肩、漩渦狀或柵欄樣排列生長(zhǎng)。內(nèi)仍白丁見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞，胞體較雪旺細(xì)胞大，扁平狀外形不規(guī)則，突起短而多，核仁明顯，有2到3個(gè)核仁，顏色較雪旺細(xì)胞淺。2、去細(xì)胞神經(jīng)橋接體的觀察：一般性狀觀察：神經(jīng)萃取過(guò)程中可見(jiàn)兩端及周圍有絮狀物析出，萃取后神經(jīng)呈淡乳白色，無(wú)光澤，其外徑及長(zhǎng)度較新鮮神經(jīng)稍減小，柔軟，有韌性。HE染色觀察：神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)消失，紅染的神經(jīng)內(nèi)膜呈波浪狀縱形排列，形成管柱狀空隙。掃描電鏡觀察：神經(jīng)內(nèi)的軸突、髓鞘已被完全去除，

6、可見(jiàn)由膠原纖維構(gòu)成的立體管狀結(jié)構(gòu)，部分管腔不規(guī)則。膠原纖維仍維持原有的位置、形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征，管內(nèi)并可見(jiàn)膜樣結(jié)構(gòu)，為雪旺細(xì)胞基底膜。3、種植雪旺細(xì)胞的同種異體神經(jīng)復(fù)合體修復(fù)兔坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)觀察：術(shù)后4周、8周、12周兩組動(dòng)物手術(shù)區(qū)局部均未出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)組足部潰瘍愈合情況、神經(jīng)纖維數(shù)日、髓鞘及再生神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)均優(yōu)于對(duì)照組。神經(jīng)傳導(dǎo)速度(NCV)于術(shù)后4周時(shí)，兩組均未見(jiàn)明顯的神經(jīng)傳導(dǎo)，術(shù)后8周、12周實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組。