人臍帶間質干細胞通過巨噬細胞參與修復腎缺血再灌注損傷研究.pdf

1、目的:間質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植對缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)等造成的腎組織損傷具有保護和促修復作用，是一種有效的細胞替代療法，然而其確切的作用機制尚不清楚。本研究旨在探討MSCs對巨噬細胞的免疫調節(jié)作用，以及巨噬細胞在MSCs發(fā)揮腎保護性作用機制中的影響，從而揭示一種新的間質干細胞移植治療腎損傷的機制，為MSCs的臨床應用提供必要的理論基礎與依據(jù)。

2、>　　 方法:采用人臍帶來源的間質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hucMSCs)，經(jīng)尾靜脈移植治療C57BL/6小鼠腎缺血-再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)模型，并分別于術前、再灌注后1～10天內不同時間點動態(tài)收集小鼠血液、組織標本，觀察hucMSCs的腎保護作用并探討機制。采用紅色熒光染料CM-Dil標記技術，對hucMSC

3、s進行體內示蹤定位。檢測小鼠血清中肌酐(creatinine，Cr)與尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平，評價hucMSCs治療前后I/R損傷小鼠的腎功能改善情況。腎組織切片H&E染色及小管損傷評分揭示hucMSCs對腎組織結構完整性的保護作用。通過PCNA免疫染色以及TUNEL分析hucMSCs移植對腎組織細胞增殖、凋亡的影響。免疫組織化學法對各組動物腎臟中F4/80+巨噬細胞進行染色，評價hucMSCs處理

4、前后I/R損傷腎組織中巨噬細胞浸潤數(shù)量的改變。同時，經(jīng)免疫組織化學檢測腎臟中單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protine-1，MCP-1)的表達，從損傷微環(huán)境中趨化因子的角度初步探討hucMSCs影響巨噬細胞浸潤的可能機制。流式分析腎組織中CD206+細胞占CD11b+巨噬細胞的百分比，評價hucMSCs對體內巨噬細胞向M2表型轉換的作用。通過尾靜脈注射脂質體包裹的氯膦酸鹽(liposome-d

5、ichloromethylene bisphosphonate，lipo-Cl2MBP)清除動物模型內的單核一巨噬細胞，再經(jīng)腎組織病理切片觀察其對hucMSCs發(fā)揮損傷修復作用的影響。采用定量RT-PCR分析hucMSCs治療前后以及巨噬細胞清除后小鼠腎組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-10的mRNA水平，研究損傷局部炎癥狀態(tài)的改變。在體外，將RAW264.7小鼠巨噬細胞株與hucMSCs共培養(yǎng)，分別檢測了巨噬細胞的免疫表型及炎

6、癥因子的表達。流式細胞儀分析共培養(yǎng)后RAW264.7細胞表面M2型巨噬細胞標記物CD206的表達情況;RT-PCR及ELISA分析RAW264.7細胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、arginase-1和IL-10的mRNA和蛋白表達水平。
　　 結果:hucMSCs經(jīng)尾靜脈注射后，可遷移、定位至小鼠肺臟與損傷腎臟的局部。hucMSCs治療組小鼠各時間點血清Cr、BUN水平明顯下降，腎組織損傷程度減輕，且腎小管細胞的增殖加速、凋

7、亡減少。hucMSCs治療組小鼠與PBS對照組相比，其腎組織中巨噬細胞的浸潤明顯減少，以再灌注后5天改變最為顯著。同時，免疫組織化學分析表明I/R損傷的腎小管上皮細胞高表達對巨噬細胞有趨化作用的因子MCP-l，而hucMSCs處理可降低該因子在腎組織中的表達。對IRI晚期（再灌注后5天）腎組織中巨噬細胞的免疫學分型進行流式細胞檢測后發(fā)現(xiàn)，hucMSCs治療組與PBS對照組相比，其腎組織中具有促修復作用的M2型巨噬細胞比例明顯增加。清除I

8、/R損傷早期小鼠體內巨噬細胞，對hucMSCs的組織修復具有明顯的促進作用;相反，對IRI晚期體內巨噬細胞的清除則可抑制hucMSCs的腎保護性作用。定量RT-PCR結果顯示，hucMSCs治療組的促炎因子合成減少而抑炎因子表達增高，具有緩解損傷局部炎癥的作用。體外與hucMSCs非接觸共培養(yǎng)(Transwell)或直接接觸培養(yǎng)的巨噬細胞株RAW264.7，其CD206表達水平明顯高于RAW264.7細胞單獨培養(yǎng)組，且炎癥因子IL-1β

9、、IL-6表達降低，arginase-1與IL-10表達升高。
　　 結論:hucMSCs移植對C57BL/6小鼠的腎缺血-再灌注損傷具有保護及促修復作用。該治療作用的發(fā)揮與其減少腎組織內巨噬細胞浸潤，加速損傷局部炎癥消退以及促進巨噬細胞表型轉換有關。hucMSCs通過對損傷局部以及體外共培養(yǎng)實驗中巨噬細胞免疫表型以及炎癥因子表達譜的調節(jié)，促進其向具有修復功能的M2型巨噬細胞轉變，從而發(fā)揮修復腎組織損傷的作用。與干細胞的轉分化和