脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒直接打點(diǎn)注射睪丸和卵巢生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠的研究.pdf

1、將外源基因整合進(jìn)動物的生殖細(xì)胞中，能產(chǎn)生攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因后代。本試驗(yàn)采用加強(qiáng)型綠色熒光蛋白作為標(biāo)記，探索出通過將質(zhì)粒(pIRES-eGFP)包裹脂質(zhì)體(lipofection2000)后注射到雌雄昆明白小鼠的生殖器官，轉(zhuǎn)染不同時期的雌雄生殖細(xì)胞，進(jìn)而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因后代的方法。 試驗(yàn)將含綠色熒光蛋白基因的加強(qiáng)型熒光蛋白質(zhì)粒(pIRES-eGFP)5.2kbcDNA完整序列按常規(guī)方法提取、純化、酶切鑒定后，用于轉(zhuǎn)基因小鼠的研究。

2、 試驗(yàn)研究了雄性個體采用單側(cè)、雙側(cè)打點(diǎn)注射睪丸對生殖能力的影響。結(jié)果表明：打點(diǎn)注射單側(cè)睪丸和雙側(cè)睪丸對雄性小鼠的生殖能力具有相同的影響。 試驗(yàn)對公鼠手術(shù)后的利用時間進(jìn)行了研究。手術(shù)后，對公鼠的睪丸組織進(jìn)行外源基因的PCR陽性檢測，5d后檢測結(jié)果呈陰性；對公鼠精液進(jìn)行外源基因PCR檢測，5d后精子陽性率呈下降趨勢，而五周后陽性率回升，說明外源基因質(zhì)粒進(jìn)入睪丸后，一部分整合到了精子的基因組中，未被整合的部分可能逐漸被降解。精原干

3、細(xì)胞分化成精子的周期約是5周，因此可以推測，手術(shù)后整合了外源基因的那部分精原干細(xì)胞在這個時候分化成攜帶外源基因的精子。由上述結(jié)果可以得到結(jié)論為：轉(zhuǎn)染公鼠最佳的利用時間為術(shù)后1～40天這個階段。 試驗(yàn)對母鼠手術(shù)后的利用時間的研究表明，母鼠進(jìn)行卵巢打點(diǎn)注射后，進(jìn)入卵巢中的質(zhì)粒由于代謝呈遞減趨勢，7d后不宜繼續(xù)使用。 將進(jìn)行睪丸注射的公鼠與正常母鼠交配所得的后代稱為A組，將進(jìn)行卵巢注射的母鼠與正常公鼠交配所得的后代稱為B組，公

4、鼠的睪丸與母鼠的卵巢均進(jìn)行手術(shù)后，交配所得后代稱為C組。三組所得的后代小鼠均為活體。比較三個試驗(yàn)組小鼠的后代基因組PCR.陽性率，得到結(jié)果如下：A組F1代小鼠尾尖組織經(jīng)PCR檢測陽性率為40.51％(32/79)。B組F1代小鼠經(jīng)尾尖組織PCR檢測陽性率為48.94％(46/94)。C組尾尖基因組PCR檢測陽性率為81.36％(48/59)，SouthernBlot陽性率為71.18％(42/59)。A、B、C三組仔鼠的陽性率中C組轉(zhuǎn)基

5、因陽性率與A、B兩組相比提高32～40個百分點(diǎn)。結(jié)果表明：脂質(zhì)體包裹外源基因直接打點(diǎn)注射睪丸和卵巢的方法，可將外源基因?qū)刖雍吐涯讣?xì)胞中，繼而通過配種獲得轉(zhuǎn)基因動物；同時轉(zhuǎn)染精子和卵母細(xì)胞比單獨(dú)轉(zhuǎn)染一種生殖細(xì)胞得到的后代陽性率高。 隨機(jī)抽取C組仔鼠5只，組織解剖后分別提取肺、肝臟、睪丸、卵巢、心臟、腎臟和尾尖共7種組織的總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5只小鼠心臟、肝臟中都沒有外源DNA存在，而其他組織中都存在，而且各

6、種組織的外源DNA存在的拷貝數(shù)不等，造成陽性信號的強(qiáng)弱程度不同。 將打點(diǎn)注射后的母鼠進(jìn)行超排，超排后12h手術(shù)取卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，可見卵母細(xì)胞發(fā)綠色熒光，證實(shí)外源基因eGFP在卵母細(xì)胞中得到表達(dá)。手術(shù)后母鼠與正常公鼠交配，手術(shù)取出2-細(xì)胞期胚胎，置于熒光顯微鏡下觀察，可見胚胎發(fā)綠色熒光。證實(shí)此方法處理母鼠，可得到能表達(dá)eGFP的轉(zhuǎn)基因胚胎。 將2～3日齡的各組仔鼠置于熒光活體成像儀中觀察，用2～3