納米脂質(zhì)體包裹pORF-mCD40L基因治療聯(lián)合化療抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：CD40配體(CD40L)屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族中重要的成員之一，在體內(nèi)主要表達(dá)在CD4<'+>T淋巴細(xì)胞表面，包括TH0、TH1、TH2細(xì)胞亞群，與為腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員的其受體CD40特異性結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，CD40主要在B淋巴細(xì)胞上表達(dá)，并且在多種腫瘤細(xì)胞包膜上也有表達(dá)。CD40L-CD40是體內(nèi)特異免疫系統(tǒng)一對(duì)重要的共刺激分子，在機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫、炎癥、移植免疫及心血管疾病等病理反應(yīng)中起重

2、要作用，CD40L-CD40結(jié)合可以激活體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；但用單純CD40L外源裸質(zhì)粒不能與體內(nèi)細(xì)胞很好結(jié)合，現(xiàn)大部分研究為應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒作為載體，而脂質(zhì)體作為新型藥物載體，能包裹抗生素、抗真菌藥、化療藥物、生物制劑等，能改變藥物的水溶性、體內(nèi)分布和體內(nèi)代謝。目前尚無脂質(zhì)體包裹CD40L抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，我們將pORF-CD40L通過用納米脂質(zhì)體包裹，制備成納米脂質(zhì)體pORF-mCD40L，觀察其體

3、內(nèi)外抗腫瘤效應(yīng)，研究聯(lián)合化療后對(duì)腫瘤治療的聯(lián)合增效作用，并進(jìn)一步研究其抗腫瘤機(jī)制。 方法：體外實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)行了腫瘤生長抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)，定量分析各種干預(yù)方式對(duì)腫瘤生長的抑制程度；另外以流式細(xì)胞儀測定體外各種干預(yù)下腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)我們建立了皮下移植瘤、肺轉(zhuǎn)移及惡性腹水動(dòng)物模型，觀察了聯(lián)合治療(聯(lián)合順鉑5 mg/kg/只，每周一次)及質(zhì)粒單獨(dú)治療在抗腫瘤治療中的作用，在皮下移植瘤模型中，我們又建立了CT26及L

4、L/2兩種腫瘤模型，兩種模型均用納米脂質(zhì)體包裹的pORF-mCD40L質(zhì)粒(50μg/只)腫瘤內(nèi)注射治療小鼠皮下移植腫瘤；在肺轉(zhuǎn)移模型，我們則用BAIB/c小鼠尾靜脈注射CT26結(jié)腸癌細(xì)胞制成，尾靜脈注射藥物觀察抗腫瘤治療效果；腹水動(dòng)物模型我們選用H22肝癌細(xì)胞注入KM小鼠腹腔來形成，各治療組腹腔內(nèi)注射藥物觀察腹水生長的不同抑制程度。 結(jié)果： 1．MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)CT26結(jié)腸癌細(xì)胞，脂質(zhì)體包裹的pORF-mCD4

5、0L聯(lián)合順鉑能明顯抑制腫瘤的生長，與對(duì)照組相比有明顯的差別。 2．CT26結(jié)腸癌細(xì)胞接種六孔板以脂質(zhì)體包裹的pORF-mCD40L等作用，以流式細(xì)胞儀測定各組腫瘤細(xì)胞的凋亡并比較，結(jié)果顯示，經(jīng)pORF-mCD40L作用后腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增加。 3．在LL/2 Lewis肺癌C57BL/6皮下移植瘤模型和CT26結(jié)腸癌BALB/c皮下移植瘤模型中我們均可觀察到聯(lián)合治療抗腫瘤效果較單一治療和NS對(duì)照治療顯著增強(qiáng)。在LL/2L

6、ewis肺癌模型中，有1只小鼠的腫瘤治療后曾經(jīng)完全消退；CT26結(jié)腸癌有模型中，有1只小鼠的腫瘤治療后完全消退；并且聯(lián)合組生存期明顯延長。另外聯(lián)合治療組腫瘤組織的免疫組化顯示治療組腫瘤細(xì)胞膜有較強(qiáng)的CD40L表達(dá)，血清中INF-γ的分泌在聯(lián)合治療組較對(duì)照組明顯增高；淋巴細(xì)胞殺傷活性也明顯增高。腹水聯(lián)合治療組有4只小鼠腹水最后消失；CT26肺轉(zhuǎn)移模型中聯(lián)合治療組治療后肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)在每只動(dòng)物肺上只有1-2個(gè)，明顯少于對(duì)照組，并且生存期大大延長

7、。 在作用機(jī)理探討中，我們對(duì)腫瘤的凋亡及治療小鼠的免疫狀況也進(jìn)行了研究，通過對(duì)腫瘤組織進(jìn)行凋亡染色(TUNEL)和HE染色，我們觀察到聯(lián)合治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)，使腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤增多。再通過淋巴細(xì)胞殺傷試驗(yàn)，檢測了小鼠脾臟的T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。 結(jié)論：通過以上試驗(yàn)，我們研究了通過納米脂質(zhì)體包裹pORF-mCD40L基因來增強(qiáng)其轉(zhuǎn)染效果并聯(lián)合順鉑化療進(jìn)行聯(lián)合治療，觀察到其能夠抑制腫瘤生長、延長荷