干預(yù)Noggin對BMP和Wnt信號通路作用的初步研究.pdf

1、Uncv BALB/c無毛小鼠是軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院（AMMS）育成的被毛突變小鼠，后代有全毛、無毛和稀毛三種表型，被國際遺傳標準化命名委員會命名為Uncv無毛小鼠。
　　毛囊（Hair follicle，HF）被視作一種由中胚層外胚層彼此間互相作用形成的微型器官。HF形態(tài)發(fā)生開始于早期胚胎階段。Uncv無毛小鼠基于其位于常染色體上的突變基因?qū)е缕銱F發(fā)育缺陷而產(chǎn)生的無毛性狀。HF形態(tài)發(fā)生依賴于BMP、Wnt、mTOR、Shh、Notc

2、h等信號通路在上皮和間充質(zhì)細胞彼此之間的互相作用。BMP通路主要參與細胞的分化，Wnt在誘導(dǎo)HF形成的進程中擔(dān)當重任，mTOR在毛發(fā)再生過程中能夠促進干細胞的活化，Shh介入形態(tài)發(fā)生及后期的分化，而Notch把控著干細胞的命運。
　　毛囊干細胞（Hair follicle stem cell，HFSC）是在HF外根鞘隆突部（Bulge， B）中的一類多能性細胞，顯現(xiàn)為未經(jīng)分化的祖細胞及標記滯留細胞，HFSC具有多種明確的表面分子標

3、記物（K15/CD34/CD200等）。HFSC屬于成體干細胞，其分化方向不單一，可向下分化形成HF和毛干（Hair shaft，HS）的某些上皮細胞，形成新的毛發(fā)，促成HF周期的形成，也可上行分化形成表皮和皮脂腺，介入皮膚傷口愈合的過程，是HF發(fā)育和周期性生長的基礎(chǔ)細胞。
　　有研究資料顯示在HF的生長發(fā)育期間Noggin基因扮演重要角色。Noggin最初分離自生長在非洲的爪蟾（Xenopus）的胚胎，通過將其mRNA打入爪蟾胚

4、胎，后者頭部顯著變大，由此得名（美國俚語中Noggin為“頭，腦袋”的涵義）。在體內(nèi)，Noggin基因?qū)Χ鄠€系統(tǒng)的發(fā)育和重塑的調(diào)控均有著重要作用，而對于在HF的發(fā)育過程中的重要作用也是不可忽視的。
　　在毛發(fā)發(fā)育過程中，角蛋白是最主要的機構(gòu)蛋白，角蛋白家族在HF的不同細胞層中有不同的表達。其中，角蛋白15（Keratin15，K15）在HFSC的研究中具有重要意義，是HFSC參與HF發(fā)育的重要分子，也是HFSC特異性的啟動子，因此

5、利用其作為啟動子，可以實現(xiàn)Cre重組酶在毛囊干細胞的表達。
　　本論文以Noggin基因為研究對象，分別從體外和體內(nèi)對其進行干預(yù)，探索干預(yù)Noggin對BMP和Wnt信號通路的影響和作用機制。研究內(nèi)容如下：
　?。?）Noggin基因沉默表達載體的構(gòu)建及效果評價
　　本實驗針對目的基因Noggin的mRNA設(shè)計四條干擾序列，并將這些序列連接到Lenti-KD慢病毒載體，用HEK-293T細胞進行包裝，得到重組慢病毒。用

6、獲得的病毒感染MC3T3-E1細胞，之后進行Puromycin篩選，獲得穩(wěn)定表達的細胞系。采用實時熒光定量PCR（qPCR）和Western Blot技術(shù)分析不同干擾序列的干擾效果。qPCR結(jié)果顯示，四種干擾序列對Noggin基因的表達都有一定的沉默效果，但只有shNoggin-1（P＜0.01）對其表達影響顯著。Western Blot結(jié)果顯示，四種干擾序列中只有shNoggin-1（P＜0.01）對Noggin的表達蛋白具有顯著的降

7、低作用。并最終確定shNoggin-1（P＜0.01）沉默效果最佳。該序列能夠干擾Noggin基因mRNA的穩(wěn)定性，從而影響蛋白的表達，可以用于部分敲除Noggin基因，從而用于研究Noggin基因的功能。
　　（2）Noggin基因沉默對BMP和Wnt信號通路表達的影響
　　本實驗借助之前構(gòu)造的Noggin基因沉默表達載體，以BMP和Wnt兩條信號通路為主，采用 qPCR和 Western Blot技術(shù)對 Noggin基因

8、沉默表達的MC3T3-E1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中BMP-2、BMP-4、BMPR-ⅠA、BMP-6、BMP-7、LEF-1、β-catenin的表達情況進行檢測分析。qPCR結(jié)果顯示，BMP信號通路中的五個基因的表達都受到Noggin基因沉默的極顯著的影響，其中BMP-2（P＜0.001）、BMP-4（P＜0.01）、BMP-6（P＜0.001）、BMP-7（P＜0.001）表達量均升高；BMPR-A（P＜0.01）表達量降低。同時Wnt信號通路

9、中的兩個基因LEF-1（P＜0.001）、β-catenin（P＜0.001）的表達也都極顯著降低。WB結(jié)果顯示，兩條信號通路中這幾種相關(guān)蛋白的表達均也受到影響，其中顯著升高的有BMP-2（P＜0.05）、BMP-4（P＜0.05）、BMP-6（P＜0.05）和BMP-7（P＜0.05）；顯著降低的是β-catenin（P＜0.05）；極顯著降低的有BMPR-ⅠA（P＜0.01）和LEF-1（P＜0.001）。
　?。?）體內(nèi)干預(yù)

10、Noggin基因后對BMP和Wnt信號通路表達的影響
　　本實驗通過將攜帶LoxP位點的Noggin基因條件性敲除小鼠與HFSC特異表達Cre重組酶的模型鼠結(jié)合進行雜交，得到F1代K15-Cre-NogginFloxed/+雜合小鼠。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析干預(yù)Noggin基因后對Noggin表達影響，結(jié)果顯示K15-Cre陽性組和陰性組小鼠皮膚HF隆起部均有Noggin的表達，且無明顯差別。采用qPCR和Western Blot

11、技術(shù)對干預(yù)Noggin基因后小鼠皮膚中BMP-4、BMP-7、LEF-1、β-catenin的表達情況進行檢測分析。在mRNA和蛋白水平結(jié)果顯示相似，表達量略有降低的有Noggin（P＞0.05）、LEF-1（P＞0.05）和β-catenin（P＞0.05），表達量略有升高的有BMP-4（P＞0.05）和BMP-7（P＞0.05），但是根據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示均無顯著差異，說明這種對Noggin的干預(yù)對BMP和Wnt信號通路并無顯著影響。

12、
　　本課題得出結(jié)論：
　　（1）成功構(gòu)建小鼠Noggin基因慢病毒介導(dǎo)的RNAi載體，并轉(zhuǎn)染小鼠MC3T3-E1細胞，得到有效抑制Noggin基因表達的穩(wěn)定細胞系，為后續(xù)研究敲低Noggin基因?qū)nt和BMP通路的影響提供基礎(chǔ)。
　?。?）通過qPCR和Western blot檢測，分析Noggin基因沉默對BMP和Wnt通路中重要因子的相對表達情況的影響，發(fā)現(xiàn)BMP信號通路中，五個因子的mRNA和蛋白水平的表達都

13、受到Noggin基因沉默的顯著影響，其中BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7表達量均升高，BMPR-ⅠA表達量降低。同時Wnt通路中的兩個因子LEF-1、β-catenin的表達也都顯著降低。結(jié)果表明，在體外Noggin基因?qū)MP信號通路可能存在反饋性抑制機制，而對Wnt信號通路存在的反饋性激活機制，為探究體內(nèi)Noggin基因?qū)MP和Wnt信號通路表達的作用提供參考。
　?。?）通過將攜帶LoxP位點的Noggin基