GVHD致肺纖維化作用的機理研究.pdf

1、研究目的:
　　本研究通過構建aGVHD肺損傷動物模型，探討alIo-HSCT后aGVHD肺損傷肺組織內微環(huán)境改變對肺上皮細胞生物學行為的影響和分子機理，闡明aGVHD肺損傷中是否存在EMT，并揭示其調控機制，為治療alIo-HSCT后aGVHD肺損傷和預防其遷延為肺纖維化尋找有效的靶標提供理論依據。
　　研究方法:
　　1)aGVHD肺損傷模型的構建:以BALB/C小鼠作為受鼠，經TBI8.0Gy全身放療預處理后接受

2、C57BL/6供鼠1O×106脾細胞+5×106骨髓細胞輸注誘導aGVHD肺損傷模型，單純接受供鼠5×106骨髓細胞輸注作為對照組，移植后隔日觀察移植受鼠生存狀況和GVHD臨床表現及嚴重程度，采集小鼠外周血檢測嵌合植入情況，同時留取aGVHD組和對照組小鼠肺組織標本進行HE和Masson染色觀察肺組織病理結構變化及纖維膠原沉積情況，闡明aGVHD肺組織中是否存在纖維化現象。
　　2)血液、肺泡灌洗液及肺組織中T淋巴細胞亞群分析:采

3、用流式細胞術檢測兩組小鼠移植后不同時機(7d，14d，21d，28d)血液、肺泡灌洗液及肺組織中CD4、CD8陽性T淋巴細胞亞群變化情況，探討不同淋巴細胞亞群分布在GVHD肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　3)血液、肺泡灌洗液及肺組織中細胞因子的表達水平檢測:采用ELISA檢測移植后不同時機(7d，14d，21d，28d)血液和肺泡灌洗液中細胞因子(TGF-β，IFN-γ，TNF-α)的表達水平;同時采用RT-PCR檢測兩組肺組織

4、細胞因子mRNA表達水平;比較aGVHD肺損傷小鼠和對照組小鼠移植后不同時機血液、肺泡灌洗液及肺組織中細胞因子表達差異，探討細胞因子在時間和空間的差異表達對GVHD肺損傷致肺纖維化發(fā)生發(fā)展的影響。
　　4)EMT信號通路調控的研究:采用免疫熒光標記技術觀察移植后發(fā)生GVHD肺損傷患者肺組織標本上皮細胞標志蛋白(E-cadherin)和間質細胞標志蛋白(Vimentin)共表達情況;進一步采用RT-PCR和Western blott

5、ing檢測GVHD組和對照組小鼠移植后不同時機肺組織中E-cadherin和Vimentin的mRNA和蛋白水平表達差異，并同時檢測EMT信號通路關鍵蛋白分子Claudin-1、β-catenin以及調控轉錄因子Slug的表達差異情況，闡明在GVHD肺損傷中是否存在EMT，并探討其發(fā)生發(fā)展的可能機制。
　　5)統計學處理：采用SPSS13.0軟件進行統計分析，各組計量資料數據以均數±標準差((x)±s）描述，兩組均數的比較采用獨立

6、樣本t檢驗進行統計學分析，以p＜0.05為差異具有統計學意義。生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank方法，以p＜0.05為差異具有統計學意義。用GraphPad Prism5軟件作圖。
　　研究結果：
　　1)成功構建C57BL/6→BALB/C aGVHD肺損傷動物模型。分別于移植后第14天、21天、28天采集BALB/C受鼠外周血進行C57BL/6供者標志H2Kb檢測，結果顯示在移植后第28

7、天兩組小鼠的供者標志H2Kb均可達到98％以上，提示供者植入成功。GVHD組小鼠出現明顯弓背、活動度減低、毛發(fā)紋理紊亂、皮膚裸露及嚴重腹瀉等典型aGVHD表現，且與BMT對照組相比生存狀態(tài)具有顯著性差異(x2=32.514，P＜0.001)，aGVHD組小鼠移植后體重下降迅速，臨床評分高于BMT組小鼠。aGVHD小鼠肺組織病理顯示肺組織內彌漫性炎癥細胞浸潤，肺泡上皮水腫、增生，肺泡間隔增厚等表現，Masson染色可見明顯膠原沉積，這些結

8、果提示移植后發(fā)生aGVHD的小鼠可出現彌漫性肺損傷改變，且肺組織內存在纖維化現象。
　　2) GVHD肺損傷小鼠在移植早期以CD4+淋巴細胞浸潤為主，到移植后期轉變?yōu)橐訡D8+淋巴細胞浸潤為主。GVHD組小鼠血液中CD4+淋巴細胞在移植后第7d、第14d顯著升高(P＜0.05)，后逐漸下降;而兩組小鼠血液中CD8+淋巴細胞在移植后各個時間點均無統計學差異(P＞0.05)。GVHD組小鼠肺泡灌洗液CD4+淋巴細胞在移植后各個時間點均

9、顯著升高(P＜0.05)，在移植后第7d達到高峰，后逐漸下降;而CD8+淋巴細胞從第14d開始明顯高于對照組(P＜0.05)，并隨移植時間逐漸升高至第28d達到高峰。GVHD組小鼠肺組織內CD4+淋巴細胞在移植后第7d、第14d、第21d顯著高于BMT對照組(P＜0.05)，但從移植后第7d起呈逐漸下降趨勢;而CD8+淋巴細胞在移植后各個時間點均顯著高于對照組（P＜0.05）。
　　3)GVHD小鼠血液、肺泡灌洗液和肺組織中細胞因

10、子(IFN-γ、TNF-α和TGF-β)出現差異性表達。GVHD組小鼠血液中IFN-γ表達水平在移植第28d顯著低于BMT對照組(P＜0.05);TNF-α表達水平在移植后第7d、第14d、第21d顯著高于對照組(P＜0.05)，但從移植后第7d起呈逐漸下降趨勢;兩組小鼠移植后各個時間點血液TGF-β表達水平均無顯著性差異(P＞0.05)。GVHD組小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ表達水平在移植后第7d、第14d顯著升高（P＜0.05），隨后

11、逐漸下降;移植后GVHD小鼠肺泡灌洗液中TNF-α表達水平逐漸升高，在移植第14d達高峰，后逐漸降低;TGF-β水平呈現逐漸上升趨勢，在移植后第14d、21d、28d顯著高于BMT對照組（P＜0.05）。GVHD組小鼠肺組織中IFN-γ表達水平在移植后第7d、第14d明顯升高(P＜0.05)，而在移植后第28d反而低于對照組（P＜0.05）;TNF-α表達水平在移植后第7d升高，后逐漸降低，在移植后第21d、28d明顯低于對照組（P＜0

12、.05）;GVHD組小鼠肺組織內TGF-β表達水平與肺泡灌洗液中的變化趨勢一致，在移植后第14d、21d、28d顯著高于BMT對照組(P＜0.05)。
　　4)GVHD肺損傷組織中存在EMT。我們觀察到移植后發(fā)生GVHD肺損傷患者肺組織中可見E-Cadherin和Vimentin共表達于肺上皮細胞表面;進一步在動物模型中檢測到GVHD組小鼠肺組織上皮細胞標志E-cadherin的蛋白表達水平顯著低于BMT組，而間質細胞標志Vime

13、ntin的蛋白表達水平顯著升高，且這種變化隨著移植時間的延續(xù)而差異更加明顯。與對照組相比較，GVHD組小鼠肺組織中的EMT信號通路關鍵蛋白分子β-catenin、Claudin-1和轉錄因子Slug的表達水平均明顯升高。這些結果提示在GVHD肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中存在EMT。
　　研究結論：
　　1)構建了穩(wěn)定的C57BL/6→BALB/C aGVHD肺損傷動物模型，并通過觀察aGVHD小鼠肺組織病理改變和膠原沉積情況，證實了

14、aGVHD小鼠肺組織中存在纖維化現象。
　　2) aGVHD肺損傷小鼠在移植早期以CD4浸潤為主，到移植后期轉變?yōu)橐訡D8浸潤為主，提示在aGVHD肺損傷過程中出現CD4→CD8淋巴細胞飄移。
　　3)aGVHD小鼠肺組織內細胞因子的失平衡可能為啟動GVHD肺損傷致肺纖維化發(fā)生發(fā)展的“開關”。
　　4)在GVHD肺損傷過程中存在EMT，肺組織內微環(huán)境的改變可導致肺上皮細胞發(fā)生EMT使上皮細胞向間質細胞轉化，是早期肺損傷