骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對血吸蟲性肝纖維化修復(fù)作用的研究.pdf

1、目的：觀察骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)單獨使用或MSCs與吡喹酮(praziquantel，PZQ)聯(lián)合應(yīng)用對血吸蟲性肝纖維化的修復(fù)作用。通過體內(nèi)外實驗探討MSCs對血吸蟲性肝纖維化的作用機(jī)制，為MSCs治療慢性血吸蟲性肝損傷提供實驗依據(jù)。
　　 方法：①應(yīng)用日本血吸蟲尾蚴多次感染的方式建立血吸蟲性肝纖維化的小鼠模型，并將小鼠分為5組：未感染對照組、PBS組、MSCs組、PZQ+PBS

2、組、PZQ+MSCs組。在感染第9、10周，MSCs處理組每只小鼠分別給予5×105MSCs經(jīng)尾靜脈移植入肝損傷小鼠，PZQ處理組于感染第9周經(jīng)灌胃給予300 mg/kg吡喹酮。②首次移植MSCs的第2、4周后分別應(yīng)用ELISA和化學(xué)發(fā)光法檢測血清中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)含量；病理切片蘇木精-伊紅染色法(HE)染色觀

3、察肝臟的組織學(xué)變化；Masson's三色染色觀察肝臟膠原沉積情況；熒光定量RT-PCR檢測肝組織膠原蛋白Ⅲ在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)；免疫組織化學(xué)和Western blotting測定肝臟Vimentin，E-cadherin和α-SMA等在蛋白水平的表達(dá)；小鼠生存期和生存狀態(tài)觀察，來評價MSCs對血吸蟲性慢性肝纖維化的修復(fù)作用。③分離、純化血吸蟲卵并提取SEA，培養(yǎng)巨噬細(xì)胞并將其分成5組：陰性對照組、SEA組、SEA+MSCs上清組(MSCs組

4、)、SEA+NRK-52E上清組(NRK-52E組)、SEA+DMEM組(DMEM組)。除陰性對照組巨噬細(xì)胞不做任何處理外，其他各組給予20μg/ml SEA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化12小時后，MSCs組、NRK-52E組和DMEM組撤SEA，分別給予MSCs培養(yǎng)48小時上清、NRK-52E培養(yǎng)48小時上清和DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。④顯微鏡觀察細(xì)胞上清培養(yǎng)12小時后各組細(xì)胞的形態(tài)；實時熒光定量RT-PCR檢測細(xì)胞上清培養(yǎng)12小時和24小時后巨

5、噬細(xì)胞TNF-α的mRNA水平；Western blotting檢測細(xì)胞上清培養(yǎng)12小時后TGF-β1的蛋白表達(dá)水平；MTT法測定細(xì)胞上清培養(yǎng)24小時和48小時后巨噬細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果：MSCs能顯著提高小鼠生存率，移植8周后，MSCs組小鼠生存率為62.5％，而PBS組僅為12.5％(p＜0.05)；移植第2周和第4周后，MSCs組小鼠脾臟指數(shù)分別為0.017±0.002和0.024±0.005，均顯著低于PBS組的0

6、.026±0.006和0.033±0.004(p＜0.01)，在移植2、4周后，PZQ+MSCs組小鼠脾臟指數(shù)亦均顯著低于PZQ+PBS組；在移植第2周和第4周，MSCs組小鼠血清HA含量分別為319.43±21.36μg/ml和186.00±30.14μg/ml，均顯著低于PBS組的388.25±45.68μg/ml和333.44±43.58μg/ml(p<0.05)；在移植第2周和第4周，MSCs組小鼠血清TGF-β1水平分別為50

7、.6±13.8 ng/ml和46.9+20.3 ng/ml，均顯著低于PBS組的87.24-24.4 ng/ml和115.2±36.2 ng/ml(p＜0.05)；MSCs移植4周后，肝臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)得到明顯改善，且以PZQ+MSCs組改善更為顯著，表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤及膠原沉積均顯著減少，蟲卵結(jié)節(jié)的平均直徑降低；移植4周后實時定量PCR檢測到MSCs組Ⅲ型膠原mRNA的相對表達(dá)水平為陰性對照的1.82±0.84倍，低于PBS組的3.56

8、±1.07倍(p＜0.05)，PZQ+MSCs組Ⅲ型膠原mRNA的相對表達(dá)為陰性對照的的1.06±0.34倍，遠(yuǎn)低于PZQ+PBS組的2.51±0.84(p＜0.01)；移植4周后，免疫組化結(jié)果顯示MSCs組，尤其是PZQ+MSCs組小鼠肝臟Vimentin陽性細(xì)胞數(shù)減少而E-cadherin陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多。Western blotting結(jié)果也提示，與PBS組比較，MSCs組小鼠肝臟Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)水平降低(p

9、＜0.05)，PZQ+MSCs組α-SMA亦顯著低于PZQ+PBS組。體內(nèi)實驗結(jié)果提示MSCs能緩解血吸蟲性肝纖維化，與PZQ聯(lián)合應(yīng)用修復(fù)效果更好。
　　 與NRK-52E上清和DMEM培養(yǎng)液比較，MSCs上清培養(yǎng)巨噬細(xì)胞12小時后，細(xì)胞變圓，體積明顯較小，偽足較少。細(xì)胞培養(yǎng)上清作用12和24小時后，MSCs組TNF-α的mRNA水平為陰性對照組的1.0±0.4倍和1.0±0.5，顯著低于NRE-52E組的10.4±3.9倍(p

10、＜0.05)和16.5±5.0倍(p＜0.01)，亦低于DMEM組的6.0±2.1倍和2.4±0.7倍(均p＜0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)上清作用12小時后，Westernblotting結(jié)果顯示MSCs組TGF-β1的表達(dá)顯著低于SEA組、NRK-52E組和DMEM組。MSCs上清作用48小時后，MTT測吸光度為0.22±0.05，顯著低于NRK-52E組的0.53±0.02和DMEM組的0.31±0.03(均p＜0.05)。體外結(jié)果表明，M