骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗肝纖維化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的作用與機(jī)制；研究在體外大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)HSCs增殖和抑制纖維合成的作用，探討其抗肝纖維化機(jī)制。 方法：MSCs的分離：從SD雄性大鼠的股骨骨髓中獲得，經(jīng)分離，培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳代至第4代，動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)及功能變化，作為SD雌性大鼠肝纖維化的移植細(xì)胞；MSCs的分離：從SD雄性大鼠的股骨骨髓中獲得，經(jīng)分離，培養(yǎng)，傳代至第4代使用；大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)和纖維原細(xì)

2、胞系復(fù)蘇后傳代使用。應(yīng)用6孔朔料培養(yǎng)板，在半透膜(transwell insert)上層接種MSCs(2×105cells/ well)，在下層接種HSC-T6細(xì)胞(2×105cells/ well)，建立上下雙層細(xì)胞共培養(yǎng)體系，常規(guī)培養(yǎng)；采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)血清肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸(HA)、層粘蛋白(LN)、IV膠原(Col-IV)；采用HE染色及Masson染色光鏡下觀察肝組織纖維化程度；RT-PCR檢測(cè)骨髓干細(xì)胞移

3、植后大鼠肝臟Col-I，RhoA，Cdc42，Rac1 mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)骨髓干細(xì)胞移植后大鼠肝臟Col-I，RhoA，Cdc42，Rac1蛋白質(zhì)表達(dá)。 結(jié)果：(1) MSCs細(xì)胞移植后對(duì)肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響：HE染色病理結(jié)果顯示：肝纖維化模型組大鼠肝臟正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，由大小不等的圓形或橢圓形肝細(xì)胞結(jié)節(jié)所構(gòu)成的假小葉取代，結(jié)節(jié)周圍纖維組織增生，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。移植未誘導(dǎo)MSCs組，2w可見

4、新生的卵圓形細(xì)胞，也可見少量新生的血管與小膽管，4w后時(shí)肝小葉肝細(xì)胞排列較整齊，出現(xiàn)中央靜脈、肝竇少量充血。移植經(jīng)HGF誘導(dǎo)后的MSCs組，與對(duì)照組比較，2w可見大量卵圓形細(xì)胞增生，并形成較多新生血管與小膽管，向肝小葉遷移，4w時(shí)肝臟基本恢復(fù)正常，炎性細(xì)胞消失。Masson染色結(jié)果顯示：誘導(dǎo)MSC組與MSC組的纖維化程度評(píng)分逐漸下降，隨時(shí)間遞增而評(píng)分遞減，且在第4周誘導(dǎo)MSC組與MSC組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。(2) ELIS

5、A法測(cè)定血清HA，LN，IV型膠原含量：移植2周后，誘導(dǎo)MSCs組血清IV型膠原與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).移植3w，4w后，誘導(dǎo)MSCs組和MSCs組各指標(biāo)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，P<0.01)，誘導(dǎo)MSCs組IV型膠原與MSCs組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各組HA，LN，IV型膠原量在1w，2w，3w未見差異，但4w與3w比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。(3) RT-PCR檢測(cè)MSCs移植后對(duì)

6、大鼠肝臟Col-I，RhoA，Cdc42，Rac1 mRNA表達(dá)的影響：移植1w后，誘導(dǎo)MSC組Cdc42與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)：移植2w后，誘導(dǎo)MSC組與對(duì)照組的RhoA和Cdc42降低比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)，且誘導(dǎo)MSCs組比MSCs組比較更明顯(P<0.05)，MSCs組Cdc42表達(dá)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；移植3w，4w后，誘導(dǎo)MSC組與對(duì)照組各指標(biāo)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

7、P<0.01，P<0.05)，且3w后誘導(dǎo)MSCs組Col-I和Cdc42表達(dá)比MSCs組下降更明顯(P<0.05)，4w后誘導(dǎo)MSCs組比MSCs組Col-I和RhoA，Cdc42下降更明顯(P<0.01)。(4) Western blot檢測(cè)MSCs移植后大鼠肝臟Col-I，RhoA，Cdc42，Rac1蛋白質(zhì)表達(dá)：移植1w后，誘導(dǎo)MSC組RhoA和Cdc42蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；移植2w后，誘導(dǎo)MSCs

8、各指標(biāo)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，MSCs組與對(duì)照組Col-I，RhoA比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。移植3w，4w后，誘導(dǎo)MSC組和MSC組與對(duì)照組各指標(biāo)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)，且3w后誘導(dǎo)MSCs組Col-I和RhoA表達(dá)比MSCs組下降更明顯(P<0.05)，4w后誘導(dǎo)MSCs組比MSCs組Col-I下降更明顯(P<0.05)。⑸HSCs與MSCs共培養(yǎng)24 h，48h，72h，HSCs

9、表現(xiàn)明顯增殖抑制(P<0.01)，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。誘導(dǎo)MSC組和MSC組與陰性對(duì)照組比較均有顯著性差異(P<0.01)，誘導(dǎo)MSC組與MSC組比較有顯著性差異(P<0.01)。⑹RT-PCR檢測(cè)MSCs與HSCs共培養(yǎng)后HSCs的Col-I，RhoA，Cdc42，Rac1 mRNA表達(dá)：共培養(yǎng)1d后，誘導(dǎo)MSCs組RhoA，Cdc42，Rac1 mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，MSCs組Cdc42表

10、達(dá)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；共培養(yǎng)2d后，誘導(dǎo)MSCs組和MSCs組各指標(biāo)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)，且誘導(dǎo)MSCs組的Cdc42與MSCs組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，共培養(yǎng)3d后，誘導(dǎo)MSCs組和MSCs組各指標(biāo)與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，且誘導(dǎo)MSCs組Col-I，Cdc42和Rac1與MSCs組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。⑺Western blot檢測(cè)MSC

11、s與HSCs共培養(yǎng)后HSCs的Col-I，RhoA，Cdc42，Rac1蛋白質(zhì)表達(dá)：共培養(yǎng)1d后，誘導(dǎo)MSC組RhoA，Cdc42表達(dá)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；共培養(yǎng)2d后，誘導(dǎo)MSCs組和MSCs組各指標(biāo)與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)，且誘導(dǎo)MSCs組Cdc42表達(dá)與MSCs組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；共培養(yǎng)3d后，誘導(dǎo)MSCs組和MSCs組各指標(biāo)與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01

12、)，且誘導(dǎo)MSCs組Col-I，RhoA和Cdc42與MSCs組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。⑻相關(guān)分析顯示：Col-I與RhoA，Cdc42，Rac1 m RNA表達(dá)的相關(guān)性分析：細(xì)胞共培養(yǎng)第一天：Col-I與RhoA，Cdc42 mRNA表達(dá)有相關(guān)性(r=0.711，P<0.05； r=0.812，P<0.05)；第二天：Col-I與Rac1有相關(guān)性(r=0.751，P<0.01)；第三天：Col-I與RhoA，C

13、dc42有相關(guān)性(r=0.826，P<0.05；r=0.646，P<0.05)。Col-I與RhoA，Cdc42，Rac1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析：共培養(yǎng)第一天：Col-I與RhoA，Cdc42蛋白表達(dá)有相關(guān)性(r=0.865，P<0.05； r=0.733，P<0.05)；第二天：Col-I與RhoA，Cdc42，Rac1有相關(guān)性(r=0.825，P<0.01； r=0.744，P<0.05； r=0.586，P<0.05)；第三天：Co

14、l-I與RhoA，Cdc42有相關(guān)性(r=0.841，P<0.01； r=0.665，P<0.05) 結(jié)論：(1) MSCs移植可抑制纖維化大鼠肝組織中膠原纖維增生，加快組織學(xué)修復(fù)，降低大鼠肝纖維化組織膠原代謝產(chǎn)物HA、LN、IV膠原的分泌。(2) MSCs移植下調(diào)肝纖維化大鼠肝組織Rho信號(hào)通路相關(guān)因子RhoA，Cdc42，Rac1 mRNA及蛋白表達(dá)，提示其拮抗CCl4誘發(fā)SD大鼠肝損害，可能是MSCs抗肝纖維化的作用機(jī)制之

15、一。(3)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)MSCs使其形態(tài)和功能發(fā)生改變，用于移植促進(jìn)肝纖維化轉(zhuǎn)歸較單純MSCs作用更強(qiáng)。⑷骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外抑制肝星狀細(xì)胞的活化及膠原表達(dá)。⑸骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制星狀細(xì)胞膠原表達(dá)涉及下調(diào)Rho信號(hào)通路，可能通過旁分泌途徑誘導(dǎo)星狀細(xì)胞凋亡而抑制其增殖。⑹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)后首先抑制Rho信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)，Rho信號(hào)通路可能是星狀細(xì)胞膠原合成的上游通路之一。⑺肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞后抑制