傳染性法氏囊病病毒VP4蛋白磷酸化修飾的研究.pdf

1、傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬成員，主要侵害雛雞體液免疫中樞器官法氏囊中的B淋巴細(xì)胞前體。IBDV基因組由分節(jié)段的A、B片段組成，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶VP1、衣殼蛋白VP2與VP3、病毒自身的蛋白酶VP4以及非結(jié)構(gòu)蛋白VP5五種蛋白。目前VP4蛋白除作為一種病毒蛋白酶被認(rèn)識(shí)外，其他一無所知，本研究分析了IBDV感染細(xì)胞內(nèi)VP4蛋

2、白的磷酸化修飾及功能。
　　以桿狀病毒表達(dá)的IBDV-VP4蛋白為免疫原，免疫6-8周齡雌性BALB/C小鼠，以HAT篩選培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，以相應(yīng)的偶聯(lián)多肽和IBDV感染細(xì)胞進(jìn)行ELISA和IFA篩選，結(jié)果獲得6株穩(wěn)定分泌的單克隆抗體細(xì)胞株4A8、5B2、5C7、5C9、7A4和7H8。亞型鑒定結(jié)果顯示它們都是IgG1亞類，輕鏈為κ型。結(jié)合表位預(yù)測(cè)與合成肽技術(shù)，鑒定出4A8、5B2、5C7三株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體共同識(shí)別磷

3、酸化抗原表位VP4-Ser26，而雜交瘤細(xì)胞5C9分泌的單克隆抗體識(shí)別非磷酸化抗原表位12FQVPQNPVVDGILASPGVLRGAHNLDCVLREGATL46;雜交瘤細(xì)胞7A4和7H8分泌的單克隆抗體共同識(shí)別非磷酸化抗原表位18pVVDGIL24，18p和21DGIL24是維持該表位的關(guān)鍵氨基酸。
　　為了深入分析IBDV感染細(xì)胞內(nèi)磷酸化修飾的VP4蛋白，借助識(shí)別磷酸化Ser26和非磷酸化位點(diǎn)的VP4蛋白單克隆抗體，分析了I

4、BDV感染和VP4基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的VP4蛋白，結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)存在Ser26磷酸化和非磷酸化兩種不同形式的VP4蛋白，VP4蛋白主要存在于細(xì)胞骨架組分中，而胞質(zhì)、膜以及核組分中VP4蛋白含量相對(duì)較少。在此基礎(chǔ)上，我們通過構(gòu)建VP4蛋白中已鑒定的四個(gè)磷酸化位點(diǎn)S26、S65、Y99和T162的丙氨酸、天冬氨酸單點(diǎn)和多點(diǎn)突變載體以及多聚蛋白VP243突變體，觀察了VP4蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)分布和這些位點(diǎn)的突變對(duì)于VP4蛋白剪切功能的影響，VP

5、4蛋白分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S26和Y99位點(diǎn)的突變對(duì)VP4蛋白的分布沒有影響，S65D（不是S65A）位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致VP4蛋白的彌散分布，T162A（不是T162D）的突變會(huì)明顯延遲VP4蛋白聚集的發(fā)生;VP4蛋白酶的活性分析結(jié)果顯示，S26、S65、Y99和T162的磷酸化與去磷酸化修飾對(duì)VP4蛋白酶的活性沒有影響，但Y99或T162位點(diǎn)的突變會(huì)嚴(yán)重影響VP4蛋白剪切功能的發(fā)揮。
　　IBDV感染過程中病毒蛋白相互關(guān)系的解析對(duì)于

6、病毒粒子的組裝和成熟的研究至關(guān)重要。為此，以DF-1細(xì)胞模型，借助免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)分析了VP4蛋白與IBDV其它編碼蛋白之間的相互關(guān)系。激光共聚焦觀察結(jié)果顯示，在IBDV感染的DF-1細(xì)胞內(nèi)以針狀或棒狀存在的是VP4蛋白，呈團(tuán)塊狀的VP4蛋白與VP1蛋白、VP2、VP3蛋白存在共定位關(guān)系;而在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，VP4與VP1蛋白、VP2、VP3蛋白不存在共定位關(guān)系。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示，在IBDV感染情況下VP4與VP1、VP3蛋白存