Wnt-β-catenin信號(hào)通路對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的： 構(gòu)建糖原合成酶激酶3 β(GSK-3 β)特異的RNAi腺病毒表達(dá)載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制GSK-3 β基因表達(dá)，為研究Wnt/GSK-3 β/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路提供技術(shù)工具；并利用構(gòu)建的RNAi腺病毒感染原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，觀察Wnt/GSK-3 β/β-catenin信號(hào)通路對(duì)高游離脂肪酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法： 設(shè)計(jì)合成二對(duì)針對(duì)GSK-3 β

2、mRNA不同位點(diǎn)的shRNA編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過(guò)體外同源重組構(gòu)建重組RNAi腺病毒表達(dá)載體；在HEK293A細(xì)胞中包裝并擴(kuò)增病毒、空斑實(shí)驗(yàn)法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定；腺病毒感染HUVEC，Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)其對(duì)GSK-3 β蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)，并進(jìn)一步檢測(cè)對(duì)細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平的影響；用游離脂肪酸(FFA)培養(yǎng)細(xì)胞，RNAi腺病毒抑制GSK-3 β表達(dá)，溴脫氧尿苷(BrDU)法檢測(cè)細(xì)胞

3、增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，探討Wnt/GSK-3 β/β-catenin信號(hào)通路對(duì)高游離脂肪酸作用下HUVEC增殖和凋亡的影響。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了針對(duì)GSK-3 β基因一個(gè)位點(diǎn)的RNAi腺病毒表達(dá)載體，經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定干擾片斷的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確； 2.在HEK293A細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增腺病毒，獲得高滴度腺病毒上清； 3.構(gòu)建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以高效抑制GSK-3 β蛋白

4、的表達(dá)，且對(duì)GSK-3 β蛋白的抑制作用可持續(xù)六天以上； 4.構(gòu)建的RNAi腺病毒感染HUVEC后可以明顯增加細(xì)胞內(nèi)β-catenin的蛋白水平，且隨著MOI值增加和時(shí)間延長(zhǎng)β-catenin蛋白量進(jìn)一步增加； 5.腺病毒和/或FFA(0.75 mmol/L)干預(yù)HUVEC，72h、96h后Brdu和流式細(xì)胞檢測(cè)，F(xiàn)FA組與正常細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖率明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯增加；RNAi腺病毒組與空病毒組相比，細(xì)胞增殖率明

5、顯增加，細(xì)胞凋亡率差別不明顯；RNAi腺病毒+FFA組與FFA組相比，細(xì)胞增殖率增加，細(xì)胞凋亡率減少；空病毒+FFA組與FFA組相比，細(xì)胞增殖率和凋亡率差別均不明顯。 結(jié)論： 構(gòu)建的GSK-3 β特異的RNAi腺病毒能夠有效抑制GSK-3 β基因的表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平，可以作為研究Wnt/GSK-3 β/β-catenin信號(hào)通路的重要技術(shù)手段；上調(diào)Wnt/GSK-3 β/β-catenin信號(hào)通路