VEGF轉(zhuǎn)染NSCs治療新生腦癱大鼠的實驗研究.pdf

1、腦性癱瘓(cerebral palsy,CP)簡稱腦癱,是目前小兒最主要的運動功能傷殘性疾病。目前對于CP的治療僅限于對癥支持,缺乏特效治療,故CP仍為當今小兒健康發(fā)育研究領域的重要課題之一。神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)具有自我更新、高增殖能力和多種分化潛能,近年來,NSCs被發(fā)現(xiàn)具有低免疫原性、能整合于宿主細胞及長期穩(wěn)定表達外源基因的優(yōu)點而成為轉(zhuǎn)基因治療的理想載體細胞。血管內(nèi)皮細胞生長因子(vaseula

2、r endothelial growthfactor,VEGF)能特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞,加速新生血管的形成,此外,VEGF還直接作用于神經(jīng)細胞,具有神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)發(fā)生作用。已有研究表明,將轉(zhuǎn)染VEGF基因的NSCs移植治療暫時性成年鼠腦缺血,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染VEGF基因的NSCs可在宿主腦組織中移行和表達基因產(chǎn)物,并對宿主局部血管和神經(jīng)結(jié)構具有保護作用。迄今為止,尚未見VEGF轉(zhuǎn)染NSCs移植治療新生CP大鼠的報道。
　　 目的:

3、本實驗擬探討VEGF轉(zhuǎn)染NSCs移植對新生腦癱大鼠的神經(jīng)保護作用。
　　 方法:本研究室既往已經(jīng)構建攜帶VEGF165基因的重組慢病毒載體pOC-FU-VEGF165,并感染體外分離培養(yǎng)的NSCs。本實驗首先使用Rice法制作新生CP大鼠動物模型,并通過神經(jīng)行為學及腦組織病理形態(tài)學對模型進行鑒定。將7日齡SD大鼠隨機分成5組,假手術組(CON組)、腦癱模型組(CP組),腦癱模型聯(lián)合緩沖液移植組(PBS組)、腦癱模型聯(lián)合VEGF轉(zhuǎn)

4、染NSCs移植治療組(VEGF+NSCs組)、腦癱模型聯(lián)合NSCs移植治療組(NSCs組)。PBS組、VEGF+NSCs組、NSCs組在CP模型后3d于大鼠左側(cè)感覺運動皮層區(qū)分別立體定位注射2μL緩沖液、轉(zhuǎn)染NSCs的攜帶VEGF基因的重組慢病毒載體(病毒感染復數(shù)moi值為50TU/個細胞,NSCs細胞個數(shù)5*104/ul)、NSCs懸液(NSCs細胞個數(shù)5*104/ul)。14日齡時觀察大鼠體重增長情況,采用VEGF免疫組織化學法檢測

5、鼠腦組織VEGF蛋白表達;3～4周齡時采用放射形迷宮覓水試驗、握持試驗及足錯誤試驗進行神經(jīng)行為學測試;35日齡采用HE染色法觀察鼠腦組織病理學。
　　 結(jié)果:第一部分應用單側(cè)頸總動脈結(jié)扎結(jié)合缺氧的方法制作新生CP大鼠,CP組動物握持時間較對照組縮短,足錯誤次數(shù)較對照組增加,HE染色提示CP組存在不同程度的腦損傷,證實CP模型動物存在神經(jīng)行為學及腦組織病理學的改變;第二部分1.體重增長率測定:VEGF+NSCs組、NSCs組體重增

6、長率明顯高于CP組和PBS組(P＜0.05);2.鼠腦組織VEGF免疫組化檢測:VEGF+NSCs組、NSCs組的VEGF免疫組化陽性細胞數(shù)較CP組和PBS組明顯增加(P＜0.05),VEGF+NSCs組較NSCs組VEGF陽性細胞數(shù)增加(P＜0.05);3.放射形迷宮覓水試驗:①覓水時間比較:VEGF+NSCs組、NSCs組的覓水時間較CP組和PBS組明顯縮短(P＜0.05),VEGF+NSCs組較NSCs組覓水時間縮短(P＜0.05

7、):②覓水錯誤次數(shù):VEGF+NSCs組、NSCs組的覓水錯誤次數(shù)較CP組及PBS組明顯減少(P＜0.05),VEGF+NSCs組較NSCs組錯誤次數(shù)減少(P＜0.05);③覓水重復次數(shù):VEGF+NSCs組、NSCs組的覓水重復次數(shù)較CP組及PBS組明顯減少(P＜0.05),VEGF+NSCs組與CON組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);4.握持試驗結(jié)果:VEGF+NSCs組、NSCs組的握持時間較CP組和PBS組明顯延長(P＜0

8、.05);5.足錯誤試驗:VEGF+NSCs組、NSCs組的錯誤次數(shù)較CP組和PBS組明顯減少(P＜0.05);6.腦組織HE染色顯示:CP組和PBS組鼠腦組織細胞排列紊亂,神經(jīng)細胞減少、變性壞死,膠質(zhì)細胞增生;VEGF+NSCs組、NSCs組細胞變性壞死減輕,偶見核固縮。
　　 結(jié)論:使用VEGF轉(zhuǎn)染NSCs移植治療新生腦癱大鼠,可增加新生鼠腦組織VEGF蛋白的表達,減輕缺氧缺血性腦損傷,改善遠期學習記憶功能,具有神經(jīng)保護作用