丹酚酸B、丹參酮ⅡA聯(lián)合體外誘導(dǎo)BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞的研究.pdf

1、冠心病、心肌梗死等缺血性心臟病是一種病勢(shì)兇險(xiǎn)、死亡率較高的全球性疾病。由于心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞不能再生，因此，當(dāng)發(fā)生心肌梗死后，心肌細(xì)胞壞死、凋亡造成細(xì)胞數(shù)目減少，心肌細(xì)胞只能由成纖維細(xì)胞填充，壞死的心肌則由瘢痕組織取代，并逐步發(fā)生心室重構(gòu)導(dǎo)致心臟收縮功能下降以至發(fā)生頑固性心力衰竭。目前心肌梗死后的治療手段主要包括藥物治療、介入治療和手術(shù)治療。中醫(yī)藥治療缺血性心臟病，臨床辯證多屬于胸痹、心痛范疇。因證論治可在一定程度上緩解或解除患者的

2、臨床癥狀，但單純中藥治療仍不能在短時(shí)間內(nèi)補(bǔ)充缺乏的心肌細(xì)胞，也就無(wú)法從根本上治愈患者。因此人們?nèi)栽诓粩鄬ふ倚碌闹委煼椒?，期望能使壞死的心肌?xì)胞得以修復(fù)或再生，干細(xì)胞移植便成為了國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類具有自我更新和多分化潛能的細(xì)胞，這些特性決定其可以在體外增殖生長(zhǎng)，在特定的細(xì)胞因子和誘導(dǎo)劑的作用下分化成各種功能細(xì)胞。BMSCs在一定的誘導(dǎo)條件下可定向分化為心肌細(xì)胞，目前大多數(shù)研究者采用的是5-氮

3、胞苷對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)，而臨床上常用的治療心血管疾病的中藥作為誘導(dǎo)劑也逐漸成為人們關(guān)注的對(duì)象。丹參在臨床上廣泛用于治療心血管系統(tǒng)疾病，其主要化學(xué)成分包括以丹酚酸B(salvianolic acid B，Sal B)為代表的水溶性酚酸類化合物和以丹參酮(Ⅱ)A為代表的醇溶性菲醌類化合物。丹參的水溶性成分以抗氧化作用等突出;脂溶性成分以抗菌、抗炎等作用更顯著。這種作用的多樣性正是丹參具有廣泛適應(yīng)癥的基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)采用中藥丹參的有效成份S

4、al B及丹參酮(Ⅱ)A作為誘導(dǎo)劑體外誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化，觀察分化過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)的變化和特異基因的表達(dá)，同時(shí)從形態(tài)學(xué)、蛋白表達(dá)等多層面比較聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)劑是否較單獨(dú)應(yīng)用一種誘導(dǎo)劑更有利于細(xì)胞的分化，從而探索體外BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的新方法。用2周齡健康SD大鼠28只，雌雄不限，體重15～30g，頸推脫臼法處死，75％酒精中浸泡10 min。將大鼠移至無(wú)菌操作間內(nèi)，用經(jīng)高壓蒸汽滅菌的器械快速取脛骨和股骨，去除周圍組織，切除

5、脛骨和股骨兩端，放入含有D-Hanks液/雙抗（青霉素100 mg/L，鏈霉素100g/L）的緩沖液中沖洗2次。另取一套無(wú)菌器械去除長(zhǎng)骨骨骺端顯露骨髓腔，用培養(yǎng)液將骨髓腔中的骨髓沖出后收集離心，1500r/min離心5min，棄上清液。加入含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基反復(fù)吹打，取一滴細(xì)胞懸液加入10μl0.04％錐蟲(chóng)藍(lán)混勻，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以1×1014/L密度接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后半

6、量換液，輕柔操作，仔細(xì)觀察細(xì)胞貼壁情況，至24h完全更換培養(yǎng)基。24h后換液，此后每3d換液1次，貼壁細(xì)胞達(dá)90％融合時(shí)用0.5％ trypsin和0.04％ EDTA(1∶1)消化，以1∶2接種傳代。
　　為了確定分離得到的細(xì)胞是否為BMSCs，以免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定細(xì)胞的表面標(biāo)志。選取第4代生長(zhǎng)良好、形態(tài)均一并接近90％融合的細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，以40g/L多聚甲醛固定后行免疫細(xì)胞化學(xué)法染色，鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志CD29及CD34。為

7、了了解大鼠BMSCs的生長(zhǎng)特點(diǎn)，描記其生長(zhǎng)曲線。選取第2、4、6代生長(zhǎng)良好、形態(tài)均一并接近90％融合的細(xì)胞以1×107/L的密度接種于24孔板，每24h消化3孔細(xì)胞并計(jì)數(shù)并繪制曲線圖。
　　以生長(zhǎng)良好、形態(tài)均一的第2代大鼠BMSCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，培養(yǎng)48h后分為四組分別加入含Sal-B、tanshioⅡA、Sal-B+ tanshioⅡA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和作為空白對(duì)照的普通生長(zhǎng)培養(yǎng)基。誘導(dǎo)分化3d后換用普通生長(zhǎng)培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)28d。選

8、取誘導(dǎo)后培養(yǎng)至28天生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)均一的細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，40g/L多聚甲醛固定，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，SP法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)desmin、α-sarcomeric actin、cTnT及Cx43心肌樣細(xì)胞標(biāo)志物;免疫熒光染色觀察細(xì)胞中desmin和cTnT兩種標(biāo)志物共表達(dá)的情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果倒置相差顯微鏡下觀察到:接種到培養(yǎng)瓶中的原代細(xì)胞，多單個(gè)圓球形漂浮于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi);24h后細(xì)胞開(kāi)始貼壁，部分細(xì)胞形態(tài)伸展、體積增大，貼

9、附于瓶壁，換液逐漸去除未貼壁細(xì)胞。5d后可見(jiàn)部分貼壁細(xì)胞形態(tài)逐漸變?yōu)榧忓N形或梭形，并伸出偽足相互連接。1周左右細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大，形態(tài)更加多樣化。9～11d細(xì)胞漸漸鋪滿培養(yǎng)瓶，進(jìn)行傳代。4代左右小圓形的造血細(xì)胞基本隨換液傳代除凈。鑒定結(jié)果顯示分離得到的BMSCs細(xì)胞纖維連接受體CD29為陽(yáng)性，造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34為陰性，說(shuō)明其表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞抗原，不表達(dá)泛白細(xì)胞抗原，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，分離得到的BMS

10、Cs在接種初24h基本未增殖;第2至3天生長(zhǎng)緩慢;第4天生長(zhǎng)速度開(kāi)始加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;第7天細(xì)胞增值速度開(kāi)始減慢，進(jìn)入平臺(tái)期。在各代細(xì)胞中生長(zhǎng)規(guī)律相近。
　　加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后，第2代細(xì)胞生長(zhǎng)48h后加入誘導(dǎo)劑，隨后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。各誘導(dǎo)組在誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后細(xì)胞形態(tài)類似，細(xì)胞貼壁、伸展，周圍伸出長(zhǎng)短不一的突起，細(xì)胞可呈現(xiàn)扁平多角形、梭形等多種形態(tài);丹酚酸B組在誘導(dǎo)7d時(shí)細(xì)胞以梭形、柱形為主，細(xì)胞形態(tài)變長(zhǎng)，體積增大

11、，大小不等，部分有分支，并互相連接。丹參酮(Ⅱ)A組誘導(dǎo)10d后細(xì)胞形態(tài)多為類長(zhǎng)柱形，核卵圓形，位于中央。二者聯(lián)合誘導(dǎo)組于誘導(dǎo)2w后開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞間連接，4w時(shí)細(xì)胞體積變小，呈條梭狀排列，可見(jiàn)類肌管樣結(jié)構(gòu)，且細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)有肌絲樣結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)期間各組均未觀察到明顯的細(xì)胞跳動(dòng)?？瞻讓?duì)照組BMSCs則始終呈纖維細(xì)胞樣外觀，培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)不發(fā)生明顯改變。
　　免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞desmin、α-sarcomeric actin、c

12、TnT及Cx43均為弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)。各誘導(dǎo)組BMSCs均可見(jiàn)desmin、α-sarcomeric actin、cTnT及Cx43陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，丹酚酸B組，丹參酮ⅡA組，丹酚酸B+丹參酮ⅡA組BMSCs以上各標(biāo)記物陽(yáng)性表達(dá)均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。其中，二者聯(lián)合誘導(dǎo)組各標(biāo)記物的陽(yáng)性率均最高。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)desmin的表達(dá)呈紅色，cTnT的表達(dá)呈綠色，兩者同時(shí)被觀

13、察到時(shí)，其重疊的部位為黃色。說(shuō)明部分細(xì)胞只表達(dá)desmin，部分細(xì)胞只表達(dá)cTnT。大部分細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩種標(biāo)記物。
　　大鼠BMSCs經(jīng)過(guò)全骨髓貼壁分離法體外培養(yǎng)后增殖分化能力強(qiáng)，生長(zhǎng)規(guī)律符合干細(xì)胞特征，可以誘導(dǎo)分化做為組織工程的“種子”細(xì)胞。體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs經(jīng)Sal-B、tanshioⅡA及二者聯(lián)合誘導(dǎo)后可定向分化為心肌樣細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示分化的心肌細(xì)胞具有早期心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征