NOR1基因的缺氧敏感性表達(dá)及誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、[NOR1基因的克隆及前期研究基礎(chǔ)]
　　 通過(guò)抑制性消減雜交和cDNA微陣列技術(shù)，發(fā)現(xiàn)NOR1的EST W95442在正常鼻咽上皮與鼻咽癌組織中存在表達(dá)差異。借助于生物信息學(xué)，采用EST介導(dǎo)的cDNA克隆方法，得到了EST W95442相應(yīng)的NOR1全長(zhǎng)cDNA序列。將NOR1轉(zhuǎn)入鼻咽癌細(xì)胞HNE1后可以抑制HNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。在25例鼻咽癌及4例正常鼻咽上皮組織中發(fā)現(xiàn)NOR1的1號(hào)外顯子區(qū)存在一個(gè)非同義的編碼區(qū)單核苷酸

2、多態(tài)性(coding Single nucleotidepolymorphism，cSNP)(Glu58Gly)。多組織膜Northern-blot分析表明，NOR1在人的骨骼肌表達(dá)最高，其次是心、腦、腎、肺。這些組織都是機(jī)體代謝功能、細(xì)胞呼吸較為旺盛部位。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NOR1含一個(gè)Nitro-oxidored domain，編碼一種潛在的氧化還原酶，主要定位在胞漿，少量位于線粒體，提示NOR1的功能可能與細(xì)胞有氧呼吸和/或細(xì)胞的代謝

3、密切相關(guān)。
　　 [NOR1在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且在缺氧誘導(dǎo)下表達(dá)升高]
　　 前期原位雜交的研究結(jié)果表明，NOR1的表達(dá)差異僅在腫瘤與非腫瘤組織之間，并且這種差異與腫瘤的臨床病理組織類型和腫瘤的轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，提示NOR1的下調(diào)是腫瘤發(fā)生的早期事件。利用CLONTECH公司的cancer profiling array（包含19種腫瘤組織以及相應(yīng)的癌旁組織）檢測(cè)發(fā)現(xiàn):NOR1在肝癌、胰腺癌、肺癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、子宮癌、

4、卵巢癌、外陰上皮癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌、皮膚癌的腫瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明NOR1的表達(dá)下調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 本研究以及前期研究所檢測(cè)的腫瘤均為實(shí)體瘤，而缺氧是實(shí)體腫瘤發(fā)生早期的共同事件。作為具有潛在氧化還原酶功能的NOR1，其表達(dá)是否會(huì)因細(xì)胞氧化還原環(huán)境的改變（如:缺氧等刺激）而改變？令人驚奇的是，利用缺氧、氯化鈷(CoCl2)以及H2O2分別對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)NOR1的表達(dá)均明顯上調(diào)，并且

5、處理后的HeLa細(xì)胞周期阻滯在S、G2期（其中缺氧誘導(dǎo)是S期，CoCl2誘導(dǎo)是S、G2期而H2O2則只是G2期）。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia induced factor，HIF-1α)是通過(guò)缺氧應(yīng)激啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄因子，NOR1的上調(diào)可能受HIF-1的調(diào)節(jié)。經(jīng)antisense-HIF-1轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞并通過(guò)CoCl2誘導(dǎo)，NOR1的表達(dá)并未隨HIF-1表達(dá)下調(diào)而下降，提示NOR1的表達(dá)與HIF-1無(wú)明顯相關(guān)。
　　 檢測(cè)腫瘤組

6、織的NOR1表達(dá)為下調(diào)，而體外的缺氧誘導(dǎo)卻使NOR1表達(dá)升高，出現(xiàn)這種矛盾是因何原因？
　　 [NOR1的表達(dá)抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡]
　　 NOR1的表達(dá)明顯抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞軟瓊脂集落形成。通過(guò)生長(zhǎng)曲線結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察轉(zhuǎn)染空白載體及NOR1的HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示NOR1過(guò)表達(dá)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著低于轉(zhuǎn)染空白載體的細(xì)胞，同時(shí)形成的細(xì)胞集落明顯較少，并且集落的體積也明顯變小。NOR1使H

7、eLa細(xì)胞在增殖過(guò)程中DNA的復(fù)制受抑而阻滯于S期，并且增加細(xì)胞的凋亡。將NOR1的反義互補(bǔ)序列轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，通過(guò)透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的核/漿比值增加的比例較對(duì)照細(xì)胞明顯增多。從上述結(jié)果說(shuō)明，NOR1可以通過(guò)周期抑制和細(xì)胞凋亡來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而在非腫瘤細(xì)胞中減少NOR1的表達(dá)可以增加細(xì)胞的惡性表型。
　　 [NOR1與細(xì)胞的代謝]
　　 將轉(zhuǎn)染空白載體及NOR1的HeLa細(xì)胞的總RNA與缺氧信號(hào)通路

8、微陣列(Oligo GEArray(R) Human Hypoxia Signaling Pathway Microarray:主要包含與缺氧應(yīng)激相關(guān)的基因:應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因、氧化還原酶類、缺氧相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子以及輔因子、凋亡相關(guān)基因、缺氧相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因等）雜交發(fā)現(xiàn)，NOR1的表達(dá)使HeLa細(xì)胞內(nèi)大部分與缺氧相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，唯一的上調(diào)基因是Bax，Bax參與凋亡的正向調(diào)節(jié)。在表達(dá)下調(diào)的基因中挑選己糖激酶基因(hexokinase

9、，HK2)、過(guò)氧物酶體增殖激活受體α(peroxisome proliferative activated receptorα，PPARA)以及缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑(factor inhibit HIF1，F(xiàn)IH-1)，通過(guò)適時(shí)定量PCR驗(yàn)證與微陣列的結(jié)果一致。HK2是糖酵解反應(yīng)的第一個(gè)限速酶，它的下調(diào)意味著糖酵解過(guò)程受抑，而糖酵解功能減弱可以增加抗癌藥物的療效。PPARA調(diào)節(jié)脂肪酸代謝且與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，微陣列結(jié)果示PPARA所調(diào)節(jié)的下

10、游基因:血管形成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein4，ANGPTL4)和溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶2(1-acyl-n-glycerol3-phosphate acyltransferase2,AGPAT2)均下調(diào)，它們分別參與降糖、升脂以及甘油三脂合成代謝功能，同時(shí)兩個(gè)基因編碼的蛋白活性下降均可以誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。FIH-1（又名HIFIAN）是一個(gè)Fe(Ⅱ)、2-氧戊二酸依賴的加雙氧酶，可以羥化HIF-1轉(zhuǎn)錄結(jié)

11、構(gòu)域中的Asp803使其轉(zhuǎn)錄活性下降而備受關(guān)注，NOR1明顯下調(diào)FIH-1的表達(dá)，提示可能增加HIF-1的轉(zhuǎn)錄功能，但微陣列結(jié)果所示受HIF-1調(diào)節(jié)的下游基因表達(dá)并無(wú)改變，說(shuō)明NOR1可能調(diào)節(jié)FIH-1作為氧化還原酶所參與的其他功能。
　　 [NOR1通過(guò)p53及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與細(xì)胞凋亡]
　　 在缺氧誘導(dǎo)的凋亡中，p53起著非常重要的作用，而且p53通過(guò)抑制DNA的合成使細(xì)胞周期阻滯于S期。NOR1的表達(dá)使p53的表達(dá)上調(diào)，

12、同時(shí)HeLa細(xì)胞的凋亡比例以及被阻滯在S期的細(xì)胞明顯增加，說(shuō)明由NOR1引起的凋亡中，p53同樣有著舉足輕重的作用。將綠色熒光標(biāo)記的NOR1轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞，用CoCl2、H2O2分別誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)兩種誘導(dǎo)都使NOR1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上大量聚集，并出現(xiàn)在腫脹的線粒體內(nèi)。同時(shí)分別檢測(cè)胞漿、線粒體的cytochrome C和caspase9的表達(dá)，兩個(gè)分子均由線粒體移至胞漿。微陣列結(jié)果顯示，Bax表達(dá)上調(diào)，BcL-2卻表達(dá)下調(diào)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體在細(xì)胞的

13、凋亡過(guò)程中，都是非常重要的細(xì)胞器，許多調(diào)節(jié)和效應(yīng)分子如:Ca2+、Bax、BcL-2等將兩者在細(xì)胞凋亡事件中緊密聯(lián)系在一起。研究者推測(cè)，NOR1引起的凋亡可能首先由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動(dòng)凋亡，導(dǎo)致大量Ca2+的釋放，激活BcL-2家族成員Bax，同時(shí)BcL-2表達(dá)下降增加Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的釋放，線粒體攝取后引起線粒體膜勢(shì)能下降，導(dǎo)致線粒體腫脹同時(shí)釋放cytochrome C和caspase9并激活caspase3等一系列凋亡效應(yīng)分子，將凋亡的信號(hào)放