siRNA靶向GATA-3對卵巢癌細(xì)胞株HO-8910生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、背景：盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但是卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率仍居高不下。人類基因組圖譜的繪制以及人類基因組研究的蓬勃興起，為從源頭上防治惡性腫瘤提供了新的途徑。近期的大量研究表明，人類基因組中與細(xì)胞增殖分化相關(guān)癌基因的激活和抑癌基因的失活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)了對惡性腫瘤進(jìn)行基因治療的理論和實(shí)踐探索。尋找和確定有治療意義的目的基因是實(shí)施腫瘤基因治療的前提。RNA干擾(RNA interfering,R

2、NAi)是一種由長約21-23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子(double-stranded RNA，dsRNA)引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，以序列特異的方式抑制同源基因的表達(dá)，其副作用小，特異性高。RNAi是生物界普遍存在的一種調(diào)控基因表達(dá)的有效方式和鑒定基因功能的重要手段，具有高效特異阻斷基因表達(dá)的特點(diǎn)，在基因功能研究、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究以及基因治療中得到廣泛的應(yīng)用。近年來，小分子干擾RNA (small interferingRNA,siRNA

3、)在腫瘤基因治療方面取得了重大進(jìn)展。通過向腫瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入能穩(wěn)定表達(dá)siRNA分子的質(zhì)?；虿《据d體來研究特定癌基因或抑癌基因的功能。 GATA-3是調(diào)節(jié)T細(xì)胞發(fā)育和分化的重要的轉(zhuǎn)錄因子，在胸腺細(xì)胞早期發(fā)育和Th2細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮了重要作用，誘導(dǎo)Th2類細(xì)胞因子的分泌，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。近年研究發(fā)現(xiàn)GATA-3在人類乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、食道癌等腫瘤中表達(dá)異常。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)GATA-3在卵巢癌細(xì)胞株HO-8910等

4、多種腫瘤細(xì)胞株中均有表達(dá)，經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)類似報(bào)道。GATA-3的表達(dá)對惡性腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特征的影響及其在免疫逃逸的發(fā)生、發(fā)展中所起作用目前尚不完全明了。我們設(shè)想通過RNAi在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)對卵巢癌細(xì)胞中GATA-3表達(dá)水平的調(diào)控，觀察該方法對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特征的影響，從而為將來該方法在臨床上的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的：探討利用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的siRNA的方法能否有效的介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)RNAi，觀察其對GATA-

5、3基因表達(dá)的抑制作用和對卵巢癌細(xì)胞株HO-8910生物學(xué)行為的影響。 方法： ①設(shè)計(jì)、構(gòu)建及鑒定GATA-3/siRNA-1、GATA-3/siRNA-2和GATA-3/siRNA-negative重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。 ②GATA-3/siRNA-1、GATA-3/siRNA-2和GATA-3/siRNA-negative重組載體在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到包裝病毒細(xì)胞株P(guān)T67中，嘌呤霉素篩選并挑選細(xì)胞克隆。收獲的

6、病毒上清液轉(zhuǎn)染卵巢腫瘤細(xì)胞HO-8910，經(jīng)過嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株HO-8910/siRNA-1、HO-8910/siRNA-2和HO-8910/siRNA-negative。通過RT-PCR和免疫組化方法鑒定GATA-3表達(dá)的抑制效果。 ③通過MTT檢測細(xì)胞增殖以及對順鉑的敏感性，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡。 ④將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株HO-8910/siRNA-1、HO-8910/siRNA-2、HO

7、-8910/siRNA-negative及HO-8910種植到裸鼠皮下檢測成瘤情況。 結(jié)果： ①成功構(gòu)建GATA-3/siRNA-1、GATA-3/siRNA-2和GATA-3/siRNA-negative重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。 ②建立了穩(wěn)定抑制GATA-3基因表達(dá)的細(xì)胞株HO-8910/siRNA-1、HO-8910/siRNA-2和對照組HO-8910/siRNA-negative ③HO-8910

8、/siRNA-1細(xì)胞株的G<,0>/G<,1>期細(xì)胞占(66.3±10.3)％，S期細(xì)胞占(8.6±1.2)％，G<,2>/M期占(27.1±3.4)％；HO-8910/siRNA-2細(xì)胞株的G<,0>/G<,1>期細(xì)胞占(64.3±14.6)％，S期細(xì)胞占(7.9±0.9)％，G<,2>/M期占(26.2±2.9)％；而HO-8910/siRNA-negative細(xì)胞株的G<,0>/G<,1>期細(xì)胞則占(50.3±9.1)％，S期細(xì)胞

9、占(9.2±1.5)％，G<,2>/M期占(33.6±4.7)％；HO-8910細(xì)胞株的G<,0>/G<,1>期細(xì)胞則占(46.3±5.2)％，S期細(xì)胞占(8.9±0.7)％，G<,2>/M期占(35.5±6.1)％。 ④ HO-8910/siRNA-1細(xì)胞株早期凋亡(0.05±0.01)％、HO-8910/siRNA-2細(xì)胞株早期凋亡 (0.04±0.01)％，HO-8910/siRNA- negative細(xì)胞株早期凋

10、亡(0.03±0.01)％，HO-8910細(xì)胞株早期凋亡(0.03±0.01)％，差異無顯著性(P>0.05)。 ⑤與HO-8910/siRNA-negative細(xì)胞株相比，HO-8910/siRNA-1、HO-8910/siRNA-2細(xì)胞株增殖速度減慢(P<0.05)，在順鉑的作用下，這種轉(zhuǎn)染組的生長受到抑制更為明顯。接種于裸鼠皮下的腫瘤生長明顯減慢(P<0.01)。 結(jié)論： ①由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的siRNA