干細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)RGCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　1.建立大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系（retinal ganglion cell5，RGC-5）的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）模型。
　　2.探討干細(xì)胞條件培養(yǎng)液(conditioned medium，CM)對(duì)RGC-5的ERS是否具有保護(hù)作用。
　　3.通過(guò)檢測(cè)ERS相關(guān)標(biāo)志物的變化，探討CM發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　將RGC-5以1

2、×105個(gè)/孔或2×105個(gè)/孔接種于12孔或6孔培養(yǎng)板內(nèi)，分為對(duì)照組、衣霉素組和治療組。對(duì)照組:空白對(duì)照組(ND組)為以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的RGC-5，干細(xì)胞條件培養(yǎng)液組(NM組)為以完全培養(yǎng)基和CM培養(yǎng)的RGC-5;衣霉素組:RGC-5接種48小時(shí)后，分別以濃度為1μg/ml（1D組）、2μg/ml（2D組）和4μg/ml（4D組）衣霉素干預(yù)，以建立RGC-5細(xì)胞的ERS模型，衣霉素干預(yù)后同時(shí)加完全培養(yǎng)基共培養(yǎng);治療組:RGC-5細(xì)胞在

3、不同濃度衣霉素干預(yù)的同時(shí)加入等量的CM共培養(yǎng)（分別為1M組、2M組和4M組）。對(duì)照組、衣霉素組和治療組在衣霉素誘導(dǎo)后24小時(shí)行Hoechst33342/PI雙熒光活染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;采用qRT-PCR法檢測(cè)各組在衣霉素誘導(dǎo)后3、6、9、12、24小時(shí)PERK、XBP1、ATF6、CHOP的mRNA表達(dá);采用Western Blot法檢測(cè)PERK、XBP1、ATF6、CHOP的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、在同一濃度衣霉素

4、誘導(dǎo)下，治療組RGC-5的細(xì)胞凋亡率明顯低于衣霉素組(P＜0.05)。
　　2、在1μg/ml衣霉素誘導(dǎo)RGC-5損傷后9和12小時(shí)，衣霉素組ATF6、XBP1和CHOP mRNA表達(dá)水平均較治療組下調(diào)，且誘導(dǎo)后9小時(shí)兩組間ATF6 mRNA表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);兩組間PERK mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯區(qū)別。
　　3、在4μg/ml衣霉素誘導(dǎo)RGC-5損傷后，治療組PERK、ATF6、CHOP、XBP1

5、 mRNA表達(dá)水平較衣霉素組依次下調(diào)，且均于誘導(dǎo)后12小時(shí)兩組間差距最明顯;其中誘導(dǎo)后12小時(shí)兩組間XBP1mRNA表達(dá)水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)
　　結(jié)論:
　　1、衣霉素可成功建立RGC-5的ERS模型。
　　2、CM可對(duì)ERS狀態(tài)下的RGC-5有一定的保護(hù)作用。
　　3、低濃度衣霉素誘導(dǎo)RGC-5發(fā)生未折疊蛋白反應(yīng)時(shí)，在誘導(dǎo)后9小時(shí)，CM可通過(guò)ATF6通路增強(qiáng)細(xì)胞的未折疊蛋白反應(yīng)而起到保護(hù)作用