內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的機制.pdf

1、背景和目的：胃癌是世界上第二位常見的惡性腫瘤,在我國其死亡率則高居惡性腫瘤死亡率之首,已嚴重威脅著人們的生命與健康。對于早期胃癌患者,術(shù)后預后尚好。在我國,2／3患者確診時已屬中晚期,喪失了根治性手術(shù)治療的機會,主要采取以化療為主的治療方案,但總體療效仍不理想,其主要原因是由于胃癌細胞的多藥耐藥現(xiàn)象導致化療失敗所致。目前,我們對胃癌細胞多藥耐藥機制的認識還不十分清楚。因此,深入探討胃癌細胞的耐藥機制十分必要。
　　 研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)

2、質(zhì)網(wǎng)應激反應作為細胞的保護性機制可能參與耐藥。但對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與胃癌細胞耐藥的關(guān)系及其耐藥機理知之甚少。為更好地模擬機體內(nèi)組織細胞的生長環(huán)境,本研究擬建立胃癌細胞的三維培養(yǎng)體系,并利用二維及三維細胞培養(yǎng)體系探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的機制,為闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導胃癌細胞耐藥的機理提供實驗依據(jù),為胃癌治療提供新的治療靶點。
　　 本課題將從三個部分對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導胃癌細胞耐藥的機制展開研究。
　　 第一部分、

3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥
　　 第一階段:建立胃癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激模型方法用衣霉素或毒胡蘿卜素分別處理胃癌細胞BGC823及SGC79010h、8h、16h及24h,Western blot技術(shù)檢測各時間點GRP78在蛋白水平的表達；用衣霉素或毒胡蘿卜素分別處理胃癌細胞BGC823及SGC79010h及8h,RT-PCR技術(shù)檢測GRP78的mRNA表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.與0h組相比,衣霉素

4、或毒胡蘿卜素處理胃癌細胞BGC823及SGC79018h、16h及24h后,GRP78蛋白表達量均明顯增高(P<0.05)。
　　 2.與對照組相比,衣霉素或毒胡蘿卜素處理胃癌細胞BGC823及SGC79018h后,GRP78 mRNA表達量均明顯增加(P<0.05)。
　　 第二階段探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可否誘導胃癌細胞耐藥方法將胃癌細胞BGC823及SGC7901分組:未加藥對照組、衣霉素(或毒胡蘿卜素)組、順鉑組、衣霉素(

5、或毒胡蘿卜素)+順鉑組、多柔比星組及衣霉素(或毒胡蘿卜素)+多柔比星組,流式細胞儀技術(shù)檢測各組細胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1.對照組、衣霉素組、順鉑組、衣霉素+順鉑組、多柔比星組及衣霉素+多柔比星組,胃癌細胞BGC823的凋亡率分別為2.1％±0.5％、11.2％±1.3％、35.9％±1.4％、18.8％±1.6％、41.5％±2.1％及22.7％±1.7％。與對照組相比,各藥物處理組細胞凋亡率均明顯增高(P<0

6、.05)；與順鉑組相比,衣霉素+順鉑組凋亡率明顯下降(P<0.05)；與多柔比星組相比,衣霉素+多柔比星組凋亡率明顯下降(P<0.05)。
　　 2.對照組、衣霉素組、順鉑組、衣霉素+順鉑組、多柔比星組及衣霉素+多柔比星組,胃癌細胞SGC7901的凋亡率分別為1.6％±0.4％、10.2％±1％、36％±1.5％、21.8％±1.3％、42.2％±2％及24.4％±1％。與對照組相比,各藥物處理組細胞凋亡率均明顯增高(P<0.0

7、5)；與順鉑組相比,衣霉素+順鉑組凋亡率明顯下降(P<0.05)；與多柔比星組相比,衣霉素+多柔比星組凋亡率明顯下降(P<0.05)。
　　 3.對照組、毒胡蘿卜素組、順鉑組、毒胡蘿卜素+順鉑組、多柔比星組及毒胡蘿卜素+多柔比星組,胃癌細胞BGC823的凋亡率分別為2.8％±0.6％、8.7％±1％、32％±1.4％、20.4％±1.5％、46％±3.2％及22.7％±1.8％。與對照組相比,各藥物處理組細胞凋亡率均明顯增高(P

8、<0.05)；與順鉑組相比,毒胡蘿卜素+順鉑組凋亡率明顯下降(P<0.05)；與多柔比星組相比,毒胡蘿卜素+多柔比星組凋亡率明顯下降(P<0.05)。
　　 4.對照組、毒胡蘿卜素組、順鉑組、毒胡蘿卜素+順鉑組、多柔比星組及毒胡蘿卜素+多柔比星組,胃癌細胞SGC7901的凋亡率分別為2.1％±0.5％、9.4％±1.1％、32％±0.9％、21.3％±0.9％、39.8％±2.6％及25.1％±1.6％。與對照組相比,各藥物處理

9、組細胞凋亡率均明顯增高(P<0.05)；與順鉑組相比,毒胡蘿卜素+順鉑組凋亡率明顯下降(P<0.05)；與多柔比星組相比,毒胡蘿卜素+多柔比星組凋亡率明顯下降(P<0.05)。
　　 第二部分、P38在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥中的作用
　　 第一階段:探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可否激活P38 MAPK方法以衣霉素或毒胡蘿卜素分別處理胃癌細胞BGC823及SGC79010h、8h、16h及24h,Western blo

10、t技術(shù)檢測各時間點P38及磷酸化P38(phospho—P38,p-P38)的表達。
　　 結(jié)果：
　　 與0h組相比,衣霉素或毒胡蘿卜素處理胃癌細胞BGC823及SGC79018h、16h及24h后,P38的磷酸化水平均明顯增高(P<0.05),各組P38蛋白表達水平無明顯變化。
　　 第二階段:明確磷酸化P38抑制劑的抑制效果方法將胃癌細胞BGC823分組:未加藥對照組、衣霉素組、SB203580(或PD16

11、9316)+衣霉素組。Western blot技術(shù)檢測各組P38及p-P38的表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.衣霉素組胃癌細胞系BGC823的P38磷酸化水平明顯高于對照組及SB203580+衣霉素組(P<0.05)；而SB203580+衣霉素組P38磷酸化水平與對照組無明顯差別(P>0.05)。
　　 2.衣霉素組胃癌細胞系BGC823的P38磷酸化水平明顯高于對照組及PD169316+衣霉素組(P<0.05)

12、；而PD169316+衣霉素組P38磷酸化水平與對照組無明顯差別(P>0.05)。
　　 第三階段:探討P38在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導胃癌細胞耐藥中的作用方法將胃癌細胞BGC823分組:未加藥對照組、SB203580(或PD169316)組、衣霉素組；SB203580(或PD169316)+衣霉素組、順鉑組、SB203580(或PD169316)+順鉑組、衣霉素+順鉑組、SB203580(或PD169316)+衣霉素+順鉑組、多柔比星組

13、、SB203580(或PD169316)+多柔比星組、衣霉素+多柔比星組、SB203580(或PD169316)+衣霉素+多柔比星組,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 1.對照組、SB203580預處理組、衣霉素預處理組、SB203580+衣霉素組、順鉑組、SB203580+順鉑組、衣霉素+順鉑組、SB203580+衣霉素+順鉑組、多柔比星組、SB203580+多柔比星組、衣霉素+多柔比星組及SB203

14、580+衣霉素+多柔比星組,BGC823的細胞凋亡率分別為:3％±0.6％、8.3％±0.9％、9.7％±1.3％、22.5％±2.6％、36.3％±2.4％、37.9％±1.4％、19.3％±1.8％、38.9％±2.6％、40％±2.1％、42.5％±2.2％、21.1％±1.9％及44.9％±2.7％。各藥物處理組細胞凋亡率均明顯高于對照組(P<0.05)； SB203580+順鉑組細胞凋亡率明顯高于SB203580預處理組(P<

15、0.05),但SB203580與順鉑并無協(xié)同效應(P>0.05)；衣霉素+順鉑組細胞凋亡率明顯低于順鉑組(P<0.05)；SB203580+衣霉素+順鉑組細胞凋亡率明顯高于衣霉素+順鉑組(P<0.05),但與順鉑組無明顯差別(P>0.05)；SB203580+多柔比星組細胞凋亡率明顯高于SB203580預處理組(P<0.05),但SB203580與多柔比星并無協(xié)同效應(P>0.05)；衣霉素+多柔比星組細胞凋亡率明顯低于多柔比星組(P<

16、0.05)；SB203580+衣霉素+多柔比星組細胞凋亡率比衣霉素+多柔比星組明顯提高(P<0.05),但與多柔比星組無明顯差別(P>0.05)。
　　 2.對照組、PD169316預處理組、衣霉素預處理組、PD169316+衣霉素組、順鉑組、PD169316+順鉑組、衣霉素+順鉑組、PD169316+衣霉素+順鉑組、多柔比星組、PD169316+多柔比星組、衣霉素+多柔比星組及PD169316+衣霉素+多柔比星組,BGC823

17、的細胞凋亡率分別為:1.8％±0.3％、7.3％±1％、11.3％±0.9％、20.2％±1.6％、37.9％±2.3％、38.8％±1.7％、18.3％±1.2％及40.3±2.4％。各藥物處理組細胞凋亡率均明顯高于對照組(P<0.05)；PD169316+順鉑組細胞凋亡率明顯高于PD169316預處理組(P<0.05),但PD169316與順鉑并無協(xié)同效應(P>1.05)；衣霉素+順鉑組細胞凋亡率明顯低于順鉑組(P<0.05)；PD

18、169316+衣霉素+順鉑組細胞凋亡率比衣霉素+順鉑組明顯提高(P<0.05),但與順鉑組無明顯差別(P>0.05)；PD169316+多柔比星組細胞凋亡率明顯高于PD169316預處理組(P<0.05),但PD169316與多柔比星并無協(xié)同效應(P>0.05)；與多柔比星組相比,衣霉素+多柔比星組細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)；PD169316+衣霉素+多柔比星組細胞凋亡率比衣霉素+多柔比星組明顯提高(P<0.05),但與多柔比星

19、組無明顯差別(P>0.05)。
　　 第三部分、三維細胞培養(yǎng)體系中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的機制
　　 第一階段:建立胃癌細胞三維培養(yǎng)體系方法用胃癌細胞BCG823建立以膠原混合液為依托的三維細胞培養(yǎng)體系,普通光學顯微鏡觀察并比較二維及三維培養(yǎng)體系下細胞的生長情況；live／dead雙熒光試劑標記二維及三維培養(yǎng)體系下的存活及死亡細胞,熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1.普通光學顯

20、微鏡觀察結(jié)果顯示:貼壁培養(yǎng)BGC823細胞形態(tài)呈多邊形,單層生長；將BGC823細胞懸液培養(yǎng)于用瓊脂預處理的培養(yǎng)板內(nèi)24h-48h,細胞聚集成類球體,生長于瓊脂上方；將瓊脂上的BGC823類球體移至膠原混合液中繼續(xù)生長24h～48h,可見類球體生長于膠原凝膠中,且有部分細胞從類球體邊緣向膠原凝膠中遷移。
　　 2.熒光顯微鏡觀察結(jié)果:貼壁培養(yǎng)BGC823細胞形態(tài)呈多邊形,死細胞少,細胞生長狀態(tài)良好；生長于瓊脂上的類球體內(nèi)死細胞少

21、,絕大多數(shù)細胞生長狀態(tài)良好；生長于膠原凝膠中的BGC823類球體內(nèi)部細胞生長狀態(tài)良好,且有部分細胞從類球體邊緣向膠原凝膠中遷移。
　　 第二階段:探討三維細胞培養(yǎng)體系中藥物的通透性方法用兩種結(jié)構(gòu)不同,但均能產(chǎn)生自發(fā)熒光的藥物UO126及多柔比星處理生長于膠原凝膠中BGC823胃癌細胞類球體2h、6h、24h及48h,普通熒光顯微鏡觀察類球體內(nèi)熒光強度。用UO126處理BGC823胃癌細胞類球體24h,共聚焦顯微鏡觀察類球體內(nèi)熒光

22、的分布。
　　 結(jié)果：
　　 1.普通熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示:在BGC823類球體培養(yǎng)基中加入可產(chǎn)生熒光的藥物UO126或多柔比星2h、6h、24h及48h時,均可在類球體中看到UO126產(chǎn)生的綠色熒光及多柔比星產(chǎn)生的紅色熒光。
　　 2.共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示:BGC823類球體培養(yǎng)基中加入可產(chǎn)生熒光的藥物UO12624h時,在類球可中央可見UO126產(chǎn)生的綠色熒光。提示BGC823類球體對藥物有較好的通透性

23、,使藥物可順利到達類球體中央。
　　 第三階段:三維細胞培養(yǎng)體系中探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的機制方法將生長于膠原混合物內(nèi)的BGC823胃癌細胞類球體分組:未加藥對照組、多柔比星組、衣霉素+多柔比星組、SB203580+衣霉素+多柔比星組,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。
　　 結(jié)果：
　　 對照組、多柔比星組、衣霉素+多柔比星組、SB203580+衣霉素+多柔比星組,BGC823的細胞凋亡率分別

24、為:2.9％±0.7％、36.4％±2.3％、17.9％±2％及39.3％±2.6％。與對照組相比,各藥物處理組細胞凋亡率均明顯增高(P<0.05)；與多柔比星組相比,衣霉素+多柔比星組細胞凋亡率明顯下降(P<0.05)；SB203580+衣霉素+多柔比星組細胞凋亡率比衣霉素+多柔比星組明顯提高(P<0.05),但與多柔比星組無明顯差別(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.衣霉素及毒胡蘿卜素均能誘導胃癌細胞BGC8