靶向VEGF和VEGFR2的shRNA在抗腫瘤研究中的應(yīng)用.pdf

1、血管新生是腫瘤生長、發(fā)展的必經(jīng)之路，與實(shí)體瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，許多腫瘤僅在新血管生成后才出現(xiàn)臨床癥狀。因此，針對腫瘤進(jìn)行抗新生血管治療具有重要的學(xué)術(shù)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。VEGF是主要的新生血管刺激因子，它與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過旁分泌和自分泌的方式來促進(jìn)血管的生成。1998年發(fā)現(xiàn)的RNA干擾技術(shù)已成為繼反義核酸后發(fā)展起來的一項(xiàng)高效特異抑制基因表達(dá)的新技術(shù)。本研究選擇采用RNA干擾技術(shù)探討靶向VEGF及其受體VEGFR2的sh

2、RNA載體的構(gòu)建及其抗腫瘤活性，并討論VEGF在腫瘤發(fā)展中的重要作用。 一、靶向VEGF的穩(wěn)定干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究由于shRNA非病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效率相對較低，而且瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA可能在細(xì)胞內(nèi)促發(fā)干擾素效應(yīng)，引起非特異性毒性，造成非靶基因特異的功能改變，因此我們設(shè)計(jì)構(gòu)建了應(yīng)用于基因功能研究的shRNA非病毒表達(dá)載體pCD-shRNA，盡量避免上述問題的出現(xiàn)。載體采用pcDNA3.0的基本質(zhì)粒序列，刪除其原有的CMV

3、啟動(dòng)子避免干擾，連入了RNA聚合酶Ⅲ可識別的、用于起始shRNA轉(zhuǎn)錄的H1啟動(dòng)子，該載體插入表達(dá)shRNA的DNA序列后可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄出shRNA，實(shí)現(xiàn)靶基因的長效抑制。 根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原理，我們選擇VEGFmRNA上四個(gè)不同靶位作為siRNA切割位點(diǎn)，合成四對DNA引物，連入載體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ELISA分析發(fā)現(xiàn)四個(gè)質(zhì)粒都可以降低細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)，但降低程度不一。選擇抑制效果最佳的質(zhì)粒pCD-V382，

4、進(jìn)行后續(xù)的研究工作。 將pCD-V382轉(zhuǎn)染人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞，經(jīng)G418篩選得到單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，采用ELISA和WesternBlotting對細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞總蛋白中的VEGF量進(jìn)行檢測，選擇表達(dá)量最低的HT1080-V3細(xì)胞株進(jìn)行深入研究。 獲得穩(wěn)定系細(xì)胞后，首先考察其在增殖方面的變化。結(jié)果顯示HT1080-V3細(xì)胞與對照組細(xì)胞相比，生長速度和克隆形成率都未改變，說明腫瘤細(xì)胞在體外的增殖能力不受VEG

5、F表達(dá)的影響。 MatrigelInvasionAssay檢測細(xì)胞20小時(shí)內(nèi)對基底膜的侵襲能力，結(jié)果顯示HT1080-V3組細(xì)胞與對照組HT1080細(xì)胞相比，穿過基底膜的數(shù)量明顯減少，HT1080-V3組和HT1080-M組(轉(zhuǎn)錄無義shRNA的HT1080細(xì)胞)穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)分別是HT1080組的26.8％和92.7％，說明VEGF持續(xù)低表達(dá)可降低細(xì)胞對基底膜的侵襲能力。 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，結(jié)果顯示12小

6、時(shí)后，HT1080-V3組的劃痕依然清晰可見，說明VEGF持續(xù)低表達(dá)可減弱細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。 對細(xì)胞的粘附能力進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明HT1080-V3組同種細(xì)胞之間的粘附能力強(qiáng)于HT1080和HT1080-M組，但其對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的異種粘附能力卻未出現(xiàn)變化。 對裸鼠進(jìn)行異種移植觀察細(xì)胞的成瘤性。結(jié)果顯示接種HT1080和HT1080-M細(xì)胞組的裸鼠分別在第9天和第15天出現(xiàn)可觸摸的腫瘤，此后腫瘤生長速度迅速，而接種HT10

7、80-V3細(xì)胞組的裸鼠至第54天仍未出現(xiàn)明顯移植瘤，免疫組化結(jié)果顯示HT1080組和HT1080-M組移植瘤中VEGF表達(dá)水平高于HT1080-V3組。說明VEGF持續(xù)低表達(dá)可顯著降低細(xì)胞的成瘤性。 上述結(jié)果表明：1.我們構(gòu)建的質(zhì)粒pCD-shRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)能實(shí)現(xiàn)持續(xù)轉(zhuǎn)錄shRNA的目的；2.靶向抑制腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF能有效防止腫瘤的發(fā)生。 二、靶向VEGF和VEGFR2的RNA干擾質(zhì)粒在前列腺癌中的治療VE

8、GF和VEGFR結(jié)合后，通過受體二聚化，誘導(dǎo)受體胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸殘基自動(dòng)磷酸化和細(xì)胞內(nèi)信號蛋白的酪氨酸磷酸化，傳導(dǎo)胞內(nèi)信號，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，除腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF受體外，許多腫瘤細(xì)胞自身也有VEGF受體表達(dá)，針對VEGF及其受體的干預(yù)措施可以阻止腫瘤的生長。 我們選擇VEGF和VEGFR2都高表達(dá)的前列腺癌DU145細(xì)胞，構(gòu)建了分別針對VEGF和VEGFR2的干擾質(zhì)粒pCSH1-V382和pCSH1-R21

9、，檢測它們各自的抗腫瘤活性。同時(shí)，我們還構(gòu)建了可以同時(shí)轉(zhuǎn)錄出VEGFshRNA和VEGFR2shRNA的質(zhì)粒pCSH1-VR2，觀察同時(shí)以該通路上的兩個(gè)蛋白為靶點(diǎn)，其抗腫瘤作用是否有所增強(qiáng)。 結(jié)果表明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCSH1-V382或pCSH1-R21后，DU145細(xì)胞的VEGF或VEGFR2在mRNA水平和蛋白水平上都出現(xiàn)了明顯降低，轉(zhuǎn)染pCSH1-VR2后細(xì)胞的VEGF和VEGFR2的mRNA和蛋白水平都出現(xiàn)了明顯降低。侵襲

10、實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染pCSH1-V382和pCSH1-R21組細(xì)胞對基底膜的侵襲能力都出現(xiàn)減弱，抑制率分別為對照組的56.1％和52.3％，轉(zhuǎn)染pCSH1-VR2組細(xì)胞的侵襲能力低于上述兩組，其抑制率為66.4％。 我們采用人前列腺癌DU145裸鼠體內(nèi)移植模型檢測三種質(zhì)粒的體內(nèi)抗腫瘤作用。結(jié)果顯示，0.75mg/kg瘤內(nèi)給藥，隔天一次，自接種后第7天起共給藥10次，第56天時(shí)pCSH1-V382和pCSH1-R21對腫瘤生長的抑制率分別

11、為60％和57.7％，兩者抑瘤效果接近。而pCSH1-VR2抑瘤率為54.8％，未見增強(qiáng)。對腫瘤組織的冰凍切片進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示pCSH1-V382、pCSH1-R21與pCSH1-VR2給藥組的腫瘤組織中VEGF水平低于對照組和pCSH1-MOCK處理組。 將上述質(zhì)粒與紫杉醇聯(lián)合用藥，紫杉醇的給藥劑量是10mg/kg，在第7天和第14天各腹腔注射給藥一次，各質(zhì)粒用量為0.75mg/kg瘤內(nèi)給藥，隔天一次，自接種后第7天

12、起聯(lián)合給藥9次。結(jié)果顯示，pCSH1-V382與紫杉醇聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。第56天時(shí)，pCSH1-V382單獨(dú)給藥組、紫杉醇單獨(dú)給藥組及兩者聯(lián)合用藥組的抑瘤率分別為61％、56％和89％，CDI值為0.82，而pCSH1-R21及pCSH1-VR2分別與紫杉醇聯(lián)合使用后，雖然抑瘤率效果均強(qiáng)于單獨(dú)給藥組，但并未顯示出協(xié)同作用。 研究表明質(zhì)粒pCSH1-V382和pCSH1-R21能夠分別特異性地抑制VEGF和VEGFR2的表達(dá)，