血清淀粉樣蛋白A對VEGFR2的表達(dá)及血管新生影響的研究.pdf

1、背景：
　　動脈粥樣硬化是冠狀動脈和腦血管疾病最重要的病理過程，是引發(fā)猝死的主要原因。血管新生是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵致病因素之一。血管新生是指內(nèi)皮細(xì)胞在原有毛細(xì)血管的基礎(chǔ)上發(fā)生增殖、遷移，形成新的血管的過程。血管新生的作用有其兩面性，一方面血管新生可用于治療缺血性心臟病，這是一種在治療上需要促進(jìn)的血管新生;另一方面血管新生可以加速動脈粥樣硬化中斑塊的進(jìn)展，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定性增加，進(jìn)而發(fā)生破裂出血等，這是一種在治療上需要抑制的血管新生。

2、根據(jù)其兩面性，可以將血管新生分為生理性和病理性兩種。探究病理性血管新生的發(fā)生機(jī)制可能為控制動脈粥樣硬化的進(jìn)展提供新的靶點。
　　血清淀粉樣蛋白A(SerumamyloidA，SAA)是一組極其保守的急性時相反應(yīng)蛋白家族，有SAA1、SAA2、SAA3及SAA4四個不同的亞型，其中SAA1是最主要的亞型。SAA主要由肝細(xì)胞合成分泌，在機(jī)體受到炎癥刺激時其血清濃度能迅速增加1000倍左右。因此，循環(huán)血液中高濃度的SAA是急性和慢性炎癥

3、疾病的重要標(biāo)志物。作為一種急性時相蛋白，SAA在多種疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、巨細(xì)胞動脈炎等）中可以促進(jìn)病理性血管新生。因此，探究SAA促進(jìn)血管新生的機(jī)制尤為重要。
　　血管內(nèi)皮生長因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的關(guān)鍵調(diào)控因子。血管內(nèi)皮生長因子受體2(Vascularendothelialgrowthfactorreceptor2,VEGFR2)是VEGF的受體之

4、一，是VEGF促血管新生信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的門戶。VEGF/VEGFR2信號通路活化后，能夠發(fā)揮促內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管新生等作用。
　　VEGFR2主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，但是其表達(dá)調(diào)控的機(jī)制尚待完善。以往研究顯示，SAA能夠促進(jìn)人頸動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humancarotidarteryendothelial，HCtAE)中VEGF的表達(dá);同時，SAA能夠通過激活p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。因此我們推測SAA可能會

5、影響VEGFR2的表達(dá)進(jìn)而引起血管新生的變化。目前，SAA，VEGFR2與血管新生的研究存在以下亟待解決的問題:①SAA能否影響VEGFR2的表達(dá);②SAA影響VEGFR2表達(dá)的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;③SAA是否能夠通過影響VEGFR2的表達(dá)引起血管新生的變化。
　　目的：
　　1.探討SAA對VEGFR2表達(dá)的影響;
　　2.探索SAA影響VEGFR2表達(dá)的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;
　　3.探索SAA引起的VEGFR2表

6、達(dá)變化在血管新生中的作用。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞
　　在內(nèi)皮完全培養(yǎng)基(Endothelialcompletemedium，ECM)中培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)，每2-3天換液一次并置于含有5％CO2的37℃溫箱中。待細(xì)胞達(dá)到合適密度時加入SAA1或待研究信號通路的激動劑以及抑制劑刺激細(xì)胞。
　　2.實時定量PCR

7、(Real-timePCR)檢測
　　利用Trizol法從HUVECs中提取出mRNA，并獲得相應(yīng)的cDNA。利用GAPDH為內(nèi)參檢測VEGFR2的mRNA表達(dá)。
　　3.蛋白印記(Westernblot)檢測
　　收集內(nèi)皮細(xì)胞，提取蛋白，以GAPDH蛋白表達(dá)為內(nèi)參檢測VEGFR2的蛋白表達(dá);以相應(yīng)總蛋白為內(nèi)參檢測p-ERK1/2,p-JNK及p-p38的蛋白表達(dá)。
　　4.成管實驗(Tubeformationa

8、ssay)
　　在96孔板中鋪入matrigel基質(zhì)膠，待膠凝固后每孔加入密度為2×104的細(xì)胞量，以未加任何刺激的組為對照顯微鏡下觀察各實驗組的成管情況。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有數(shù)值均用Prismversion5和SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用單因素方差分析來確定有無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P＜0.05代表數(shù)據(jù)間具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.SAA上調(diào)HUVECs細(xì)胞中

9、VEGFR2的表達(dá)
　　使用不同濃度梯度（0，5,10和50μg/ml）的SAA刺激HUVECs，24小時后收集細(xì)胞，提取蛋白和mRNA。通過Westernblot及Real-timePCR發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SAA呈劑量依賴性的方式上調(diào)VEGFR2的表達(dá)(P＜0.01);以固定濃度的SAA（10μg/ml）刺激細(xì)胞，選擇不同時間點（0，2,3,6,12和24小時）收集細(xì)胞，提取蛋白和mRNA。通過Westernblot及Real

10、-timePCR發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，SAA呈時間依賴性的方式上調(diào)VEGFR2的表達(dá)(P＜0.05)。
　　2.膜受體FPRL1能夠介導(dǎo)SAA誘導(dǎo)的VEGFR2表達(dá)上調(diào)
　　用膜受體FPRL1的特異性抑制劑WRW4預(yù)刺激細(xì)胞，通過Westernblot發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)SAA刺激組相比，WRW4能顯著抑制SAA誘導(dǎo)的VEGFR2的表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)。用FPRL1特異性的激動劑WKYMVm刺激細(xì)胞，WKYMVm組較對照組能明顯上

11、調(diào)VEGFR2的表達(dá)(P＜0.01)。這一結(jié)果表明，F(xiàn)PRL1能夠介導(dǎo)SAA誘導(dǎo)的VEGFR2表達(dá)上調(diào)。
　　3.MAPKs信號通路能夠介導(dǎo)SAA誘導(dǎo)的VEGFR2表達(dá)上調(diào)
　　使用SAA刺激細(xì)胞后，通過Westernblot發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ERK1/2,JNK及p38的磷酸化水平顯著增強(qiáng)且在1小時達(dá)到高峰(P＜0.01)。然后分別使用三者特異性的抑制劑PD98059,SP600125以及SB203580刺激細(xì)胞6,12

12、及24小時。Westernblot結(jié)果顯示，加用三種抑制劑組較單獨(dú)SAA刺激組均能不同程度的降低VEGFR2的表達(dá)(P＜0.05)。這一結(jié)果表明，MAPKs信號通路能夠介導(dǎo)SAA誘導(dǎo)的VEGFR2表達(dá)上調(diào)。
　　4.膜受體FPRL1能夠調(diào)控下游MAPKs信號通路的活化
　　利用受體FPRL1的特異性抑制劑WRW4預(yù)處理細(xì)胞，Westernblot結(jié)果顯示，WRW4組較單獨(dú)SAA刺激組能明顯抑制MAPKs信號通路的磷酸化（P＜

13、0.05）。另外，我們用FPRL1的特異性激動劑WKYMVm處理細(xì)胞，Westernblot結(jié)果顯示，與對照組相比，用WKYMVm處理細(xì)胞組能夠顯著上調(diào)MAPKs信號通路的磷酸化水平(P＜0.01)。這一結(jié)果表明，F(xiàn)PRL1作為上游信號分子能夠調(diào)控MAPKs信號通路的活化。
　　5.SAA誘導(dǎo)的VEGR2表達(dá)增多能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生
　　利用受體VEGFR2的特異性抑制劑BIBF1120及FPRL1/MAPKs信號通路

14、的激動劑和抑制劑刺激細(xì)胞，成管實驗結(jié)果顯示，較單獨(dú)SAA刺激組相比，加用B1BF1120，WRW4,PD98059,SP600125及SB20358均能夠顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞成管(P＜0.01)。而WKYMVm處理組較對照組相比則顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成管(P＜0.01)。這些結(jié)果證實SAA誘導(dǎo)的VEGFR2的表達(dá)及相關(guān)信號通路能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生。
　　結(jié)論：
　　1.SAA能夠上調(diào)HUVECs細(xì)胞中VEGFR2的表達(dá);