靶向NRas和c-Myc的shRNA表達載體的構建及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、RNA干擾已經(jīng)發(fā)展成為一種非常有潛力的腫瘤基因治療手段。用于治療的RNA干擾物質主要有化學合成siRNA和shRNA表達載體。在體內(nèi)shRNA表達載體具有更穩(wěn)定的RNA干擾作用，便于進行較長時間的基因功能研究。shRNA表達載體法分為病毒載體法和非病毒載體法兩種。shRNA病毒表達載體的轉染效率高，但安全性低。因此研究安全性較高的shRNA非病毒表達載體是很有必要的。 一、一種可同時表達多種shRNA的載體pCSH1的設計與構建

2、shRNA非病毒表達載體安全性高，但它轉染效率較低。主要原因是質粒DNA難于從細胞質進入細胞核，可通過降低質粒的大小來改善。質粒DNA在細胞內(nèi)可以促發(fā)干擾素效應，引起非特異毒性，可通過降低質粒的用量來解決。我們構建了用于治療的shRNA非病毒表達載體pCSH1，在設計時注意了盡量提高RNA干擾的效率和盡量降低載體的非特異毒性兩個問題。載體采用了pUC19的質?；拘蛄?，RNA聚合酶Ⅲ識別的H1啟動子，以使載體盡量小。并將多個shRNA轉

3、錄單位利用同尾酶的特性串聯(lián)在一個質粒上，以使載體的用量降低。 為了驗證pCSH1是否可以實現(xiàn)單個基因的RNA干擾，我們設計針對NRas和c-Myc的shRNA靶序列，分別構建入pCSH1，分別命名為pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3。并用RT-PCR和WesternBlot檢測質粒瞬時轉染后的靶基因RNA水平和蛋白水平的變化。結果表明pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3可以特異性降低靶基因的RNA水平和蛋白

4、水平。 為了驗證pCSH1是否可以實現(xiàn)兩個shRNA轉錄單位的串聯(lián)，我們構建了針對腫瘤相關基因NRas同一位點的shRNA轉錄單位串聯(lián)的載體pCSH1-2shN2，以及分別針對NRas和c-Myc的shRNA轉錄單位串聯(lián)的載體pCSH1-shNM。生長曲線法實驗表明相同質量的pCSH1-2shN2對HepG2細胞生長的抑制明顯強于pCSH1-shN2。WesternBlotting分析顯示pCSH1-shNM既能有效抑制NRas

5、又能有效抑制c-Myc的基因表達水平。我們還構建了含3～6個shRNA轉錄單位串聯(lián)的載體，結果表明pCSH1能將多個shRNA轉錄單位串聯(lián)在一個載體上。 我們構建的載體pCSH1有如下特點：1.分子量小；2.能將shRNA轉錄單位串聯(lián)；3.串聯(lián)之后能進行有效的干擾。 二、以NRas為靶點的shRNA表達載體的抗腫瘤活性研究約30％人腫瘤經(jīng)常通過點突變使Ras蛋白處于組成型活性狀態(tài)。NRas突變在肝癌中的出現(xiàn)頻率約為30％

6、，在肝癌治療中是一個理想的靶點。運用RNA干擾技術可以特異地沉默突變型Ras的表達。 研究結果顯示，靶向NRas的兩個載體pCSH1-shN1和pCSH1-shN2瞬時轉染NRas突變的人肝癌HepG2細胞和人纖維肉瘤HT-1080細胞，以及NRas基因表達增加的人乳腺癌上皮MCF-7細胞，都能夠導致NRas蛋白表達量降低，并且干擾作用可以達到比較高的特異性，能識別只有一個堿基差異的NRasmRNA。細胞生長曲線法和克隆形成法檢

7、測pCSH1-shN2對細胞增殖的影響，結果表明pCSH1-shN2瞬時轉染HepG2細胞后細胞生長速度降低，克隆形成率顯著降低。說明pCSH1-shN2對細胞增殖和克隆形成都有明顯影響。 流式細胞法檢測pCSH1-shN2對HepG2細胞周期分布的影響，結果表明pCSH1-shN2質粒瞬時轉染處理后細胞發(fā)生了微弱的G1期阻滯，G1期細胞的百分比由57.4％增加到65.4％。轉染后用G2期阻滯藥nocodazole處理細胞12小

8、時后，control組、pCSH1-shMock組和pCSH1-shN2組的G1期細胞百分比分別為4.6％、6.7％和13.8％。結果說明pCSH1-shN2能夠導致部分G1期阻滯。 WesternBlot結果顯示，pCSH1-shN2轉染后，HepG2細胞內(nèi)NRas、p-ERK、cyclinD1、p-RB、c-Myc的蛋白水平降低，并呈時間依賴性。結果說明pCSH1-shN2通過特異性干擾mRNA抑制NRas的表達，導致信號蛋

9、白p-ERK、cyclinD1、p-RB、c-Myc水平的下降，進一步抑制細胞的增殖。 采用人肝癌HepG2裸鼠體內(nèi)移植模型檢測載體pCSH1-shN2的體內(nèi)抗腫瘤作用。結果顯示，0.5mg/kg瘤內(nèi)給藥，隔天1次，共8次，第27天時pCSH1-shN2和pCSH1-shMock對腫瘤生長的抑制率分別為52％和10％；加倍劑量，第39天時pCSH1-shN2和pCSH1-shMock對腫瘤生長的抑制率分別為69％和38％；劑量加

10、倍后pCSH1-shN2和pCSH1-shMock對腫瘤生長的抑制率分別提高了17％和28％，提示劑量較大時質粒對細胞的非特異毒性比較明顯，結果與體外實驗一致。 把pCSH1-shN2轉染到人肝癌HepG2細胞中，獲得了NRas表達被干擾的單克隆HepG2/n9細胞，并采用SRB法檢測該細胞對化療藥物的敏感性。結果表明，HepG2/n9細胞對長春新堿的敏感性提高了一倍，而對紫杉醇、粉防己堿和阿霉素的敏感性沒有變化或降低，表明Hep

11、G2細胞中NRas通路降低會增加細胞對長春新堿的敏感性。結果提示，長春新堿與pCSH1-shN2聯(lián)合處理裸鼠移植瘤HepG2可能會有比較好的抑瘤率。 以上結果表明，非病毒載體pCSH1-shN2通過特異性干擾NRas的表達抑制腫瘤細胞的增殖。pCSH1-shN2在體內(nèi)也具有一定的抑制腫瘤生長的作用。因此，以NRas為靶點的shRNA的非病毒載體pCSH1-shN2可能成為一種新型腫瘤基因治療藥物。 三、可同時表達兩種sh

12、RNA的載體pCSH1-shNM的抗腫瘤活性研究癌基因Ras和Myc經(jīng)常在腫瘤細胞中過表達或突變。本實驗將以NRas和c-Myc為靶點的shRNA模板序列串聯(lián)構建到載體pCSH1中，命名為載體pCSH1-shNM，使該載體在導入HepG2細胞后即可同時抑制兩個基因的表達?？寺⌒纬煞y定表明pCSH1-shNM對HepG2細胞克隆形成的抑制作用大于pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3。結果提示同時干擾NRas或c-Myc對細胞克

13、隆形成的抑制作用強于單獨干擾NRas或c-Myc。 流式細胞法結果顯示，經(jīng)過pCSH1-shNM質粒瞬時轉染處理后，細胞周期分布沒有明顯變化，但凋亡細胞百分比明顯高于pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3單獨轉染組。結果提示同時干擾NRas或c-Myc能明顯增強凋亡誘導作用。WesternBlot分析表明，pCSH1-shNM組與pCSH1-shN2組相關蛋白水平變化一致的有NRas、CDK2、p-ERK、p-RB，pC

14、SH1-shNM組與pCSH1-shMyc3組相關蛋白水平變化一致的有c-Myc、CyclinA。與其它組不同的是pCSH1-shNM組顯著提高Raf-1的表達，說明NRas和c-Myc在信號通路中有聯(lián)系，表達同時降低后信號通路會出現(xiàn)與任一單獨干擾不同的變化。 采用人肝癌HepG2裸鼠體內(nèi)移植模型檢測pCSH1-shNM的體內(nèi)腫瘤生長抑制作用。結果顯示，1mg/kg瘤內(nèi)給藥，隔天1次，共給藥8次，第35天時pCSH1-shN2對腫

15、瘤生長的抑制率為70％，pCSH1-shMyc3對腫瘤生長的抑制率為80％，pCSH1-shNM對腫瘤生長的抑制率為70％。結果表明pCSH1-shNM對腫瘤生長的抑制作用與pCSH1-shN2接近，但比pCSH1-shMyc3低。同時抑制NRas和c-Myc的表達在裸鼠體內(nèi)移植瘤HepG2中并未表現(xiàn)出協(xié)同作用。 綜上所述，腫瘤細胞中存在的異常表達的癌基因可以通過RNA干擾的手段同時抑制，并能比單基因抑制更有效地逆轉某些惡性表型