靶向不同腫瘤基因的shRNA瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建及聯(lián)合抗腫瘤活性的研究.pdf

1、癌癥的發(fā)生與多基因異常有關(guān)，包括癌基因的活化和抑癌基因的失活。RNA干擾被認(rèn)為是一種非常有潛力的腫瘤治療手段，利用RNA干擾技術(shù)抑制癌基因的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型。但僅就一個(gè)基因?yàn)榘悬c(diǎn)往往只能部分逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型，治療效果有限。為尋求更加理想的抗腫瘤效果，可以在兩方面進(jìn)行研究：第一是將RNA干擾技術(shù)聯(lián)合化療藥物，第二是利用RNA干擾技術(shù)靶向多個(gè)癌基因。本文就這兩方面進(jìn)行了研究。 第一部分、靶向N—Ras的shRNA聯(lián)合長春

2、新堿的抗腫瘤活性研究。 一、pCSH1—shNR聯(lián)合VCR的體外抗肝癌活性。 SRB法檢測pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對(duì)HepG2細(xì)胞的生長抑制。結(jié)果顯示，pCSH1—shNR處理的細(xì)胞存活率為55.0％，1.5nMVCR的細(xì)胞存活率為77.24％，pCSH1—shNR與1.5nMVCR聯(lián)合處理的細(xì)胞存活率為34.60％，兩藥相互作用系數(shù)(CDI)為0.76；VCR濃度為2.5nM時(shí)的細(xì)胞生存率為46.18％，pCSH

3、1—shNR與2.5nMVCR聯(lián)合處理的細(xì)胞存活率為17.32％，CDI為0.64。結(jié)果說明轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR聯(lián)合長春新堿對(duì)HepG2細(xì)胞的生長有顯著協(xié)同抑制作用。 pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對(duì)HepG2細(xì)胞克隆形成能力的抑制。單獨(dú)轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR時(shí)，克隆形成率為50％，單獨(dú)VCR(2.5nM)處理時(shí)，克隆形成率為13.75％，pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合時(shí)，克隆形成率為6.67％，與單獨(dú)處理比較克隆形成抑

4、制率有明顯提高。 二、不同處理對(duì)增殖相關(guān)蛋白水平變化的影響。 不同處理對(duì)蛋白激酶ERK1/2及Akt活性的影響。轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR使HepG2細(xì)胞中的ERK1/2和Akt的磷酸化水平下降；VCR處理后，ERK1/2和Akt的磷酸化水平也下降；pCSH1—shNR聯(lián)合VCR組的ERK1/2和Akt的磷酸化水平下降幅度更大，說明pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合可以共同增強(qiáng)對(duì)Ras/Raf/MEK/ERK1/2和Ras/

5、PI3K/Akt通路的阻遏作用。 細(xì)胞核因子NF—κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其過表達(dá)和活化與癌癥的發(fā)生相關(guān)。ERK1/2及Akt都參與對(duì)NF—κB的調(diào)節(jié)。在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中，NF—κB的下調(diào)可以誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)VCR的化療敏感性。我們檢測了不同處理對(duì)NF—κB通路的影響，結(jié)果顯示pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理組的NF—κB信號(hào)通路的活性被整體下調(diào)，并且被抑制的程度大于其它處理組。 表皮生長因子受體(EGFR)參與R

6、as信號(hào)通路的活性調(diào)節(jié)及細(xì)胞對(duì)VCR作用的響應(yīng)，在HepG2中表達(dá)組成型的磷酸化EGFR。Western Blot檢測pCSH1—shNR及VCR處理對(duì)EGFR表達(dá)及活性的影響，結(jié)果顯示pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理協(xié)同下調(diào)了EGFR的表達(dá)，N—Ras的表達(dá)抑制減弱了細(xì)胞響應(yīng)VCR處理時(shí)對(duì)EGFR的活化。 三、pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響。 流式細(xì)胞儀檢測pCSH1—shNR聯(lián)合VC

7、R對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響。結(jié)果顯示，pCSH1—shNR處理對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響不是很明顯。用VCR(1.5nM和2.5nM)處理細(xì)胞后，低劑量VCR可以引起S期阻滯，高劑量VCR可以引起G2/M期阻滯，結(jié)果說明VCR引起的細(xì)胞周期阻滯是劑量依賴性的。pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理，結(jié)果顯示pCSH1—shNR可以降低VCR引起的S期或G2/M期阻滯。 Western blot檢測細(xì)胞周期蛋白(Cycli

8、n)和依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶(Cdk)的變化。結(jié)果顯示，pCSH1—shNR、VCR、pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理都下調(diào)了cyclinD1、Cdk2、Cdk4和Cdk6的表達(dá)，與單獨(dú)處理比較聯(lián)合處理的下調(diào)作用顯著提高。此外，pCSH1—shNR可以逆轉(zhuǎn)VCR引起的cyclin E和cyclin Bl的上調(diào)作用，VCR抑制pCSH1—shNR對(duì)Cdc2的上調(diào)作用。因此pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理使Cyclins和Cdk

9、s的整體活性水平趨于下降。 Western blot檢測Rb磷酸化和E2F—1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示pCSH1—shNR使Rb磷酸化水平略有下調(diào)，E2F—1表達(dá)略有下降；VCR使Rb磷酸化水平大幅提高，E2F—1表達(dá)略有下降；pCSH1—shNR聯(lián)合VCR使Rb磷酸化水平顯著高于對(duì)照組，但也顯著低于VCR組，聯(lián)合組的E2F—1表達(dá)下降最多。結(jié)果說明pCSH1—shNR抑制了VCR刺激Rb磷酸化的作用，促進(jìn)了對(duì)E2F—1表達(dá)的下調(diào)作

10、用。 四、pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。 流式細(xì)胞儀檢測pCSH1—shNR聯(lián)合VCR對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。結(jié)果顯示，pCSH1—shNR的凋亡誘導(dǎo)率為6.07％，VCR的凋亡誘導(dǎo)率為12.29％，而pCSH1—shNR聯(lián)合VCR的凋亡誘導(dǎo)率為22.82％，說明pCSH1—shNR聯(lián)合VCR協(xié)同誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。 Westernblot檢測結(jié)果顯示，pCSH1—sh

11、NR聯(lián)合VCR協(xié)同誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡與Bax無關(guān)，但pCSH1—shNR顯著下調(diào)凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)量，從而抑制VCR對(duì)Survivin的上調(diào)，降低了Survivin對(duì)凋亡的抑制作用，進(jìn)一步增強(qiáng)了VCR對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。 五、pCSH1—shNR聯(lián)合VCR誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的作用。 采用SA-β—gal染色法檢測轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR聯(lián)合VCR誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞衰老的作用。結(jié)果顯示，pCSH1

12、—shNR的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)率為11.32％，VCR(2.5nm)的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)率為8.23％；pCSH1—shNR聯(lián)合VCR的細(xì)胞衰老誘導(dǎo)率為18.76％。結(jié)果說明pCSH1—shNR聯(lián)合VCR誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的能力更強(qiáng)。 六、pCSH1—shNR對(duì)VCR誘導(dǎo)MDR1基因表達(dá)的影響。 腫瘤細(xì)胞對(duì)VCR的抗性與MDR1基因表達(dá)產(chǎn)物P—糖蛋白(P—gp)的過表達(dá)有關(guān)，而ras癌基因可以調(diào)控MDR1基因的表達(dá)。WesternBlot

13、檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染pCSH1—shNR后進(jìn)行VCR處理的HepG2細(xì)胞內(nèi)P—gp的升高幅度明顯小于VCR處理組。 綜上所述，pCSH1—shNR與VCR聯(lián)合處理對(duì)HepG2細(xì)胞的生長產(chǎn)生了顯著的抑制效果，細(xì)胞凋亡率增多，細(xì)胞表面的EGFR的表達(dá)和活性都降低，細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2和Akt的活性被協(xié)同抑制，Cyclin和Cdk的整體活性水平趨于下降，轉(zhuǎn)錄因子E2F—1和NF—κB的表達(dá)和活性被下調(diào)，pCSH1—shNR抑制了VCR

14、引起的Survivin和MDR1基因表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果提示，靶向特異基因的RNA干擾技術(shù)與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于肝癌治療具有好的療效。 第二部分、MDM2和Pin1的shRNA表達(dá)載體構(gòu)建及其抗腫瘤活性。 一、靶向MDM2和Pin1的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建。 采用本室已證明可以有效抑制MDM2表達(dá)的RNA干擾序列，以及文獻(xiàn)報(bào)道中已證明可以有效抑制Pin1表達(dá)的RNA干擾序列，將這兩段序列構(gòu)建到已有的多基因shRN

15、A表達(dá)載體pCSH1—1中，新構(gòu)建的載體命名為pCSH1—shPM。 二、pCSH1—shPM對(duì)靶蛋白表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)選擇人的成纖維肉瘤HT1080細(xì)胞進(jìn)行研究。Westernblot檢測顯示，轉(zhuǎn)染pCSH1—shMDM2可以下調(diào)MDM2的表達(dá)，轉(zhuǎn)染pCSH1—shPin1可以降低Pin1的表達(dá)，也可以使得MDM2的表達(dá)有所下降。轉(zhuǎn)染pCSH1—shPM可以同時(shí)有效降低MDM2和Pin1的表達(dá)，對(duì)MDM2的下調(diào)程度略大

16、于轉(zhuǎn)染pCSH1—shMDM2組，說明抑制Pin1的表達(dá)可能下調(diào)MDM2的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，在低表達(dá)Pin1的HT1080-shPin1穩(wěn)定細(xì)胞系中，MDM2的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，說明在HT1080細(xì)胞中抑制Pin1的表達(dá)確實(shí)可以下調(diào)MDM2的表達(dá)。 三、pCSH1—shPM對(duì)細(xì)胞生長的影響。 SRB法檢測不同處理對(duì)細(xì)胞生長的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCSH1—shPin1和pCSH1—shMDM2都對(duì)HT1080細(xì)胞

17、的生長有抑制作用，轉(zhuǎn)染pCSH1—shPM對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用強(qiáng)于pCSH1—shPin1或pCSH1—shMDM2單獨(dú)處理，說明同時(shí)抑制MDM2和Pin1的表達(dá)更有效地抑制了HT1080細(xì)胞的生長。 四、pCSH1—shPM對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。 采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同處理對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pCSH1—shPin1、pCSH1—shMDM2和pCSH1—shPM都能夠減弱HT1080細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，各個(gè)