組蛋白低乙?；抡{(diào)PIB5PA表達(dá)在人黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的:黑色素瘤是來(lái)源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的一種最致命的皮膚惡性腫瘤。由于其惡性程度極高,且易于早期轉(zhuǎn)移,患者臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)已喪失手術(shù)治療的機(jī)會(huì),而且放化療效果普遍不佳,導(dǎo)致其治療難度大。因此,深入了解黑色素瘤的發(fā)病機(jī)理和耐藥機(jī)制,以尋求針對(duì)特異性分子靶點(diǎn)的個(gè)體化治療成為目前黑色素瘤治療的熱點(diǎn)。目前研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路在70％黑色素瘤中被高度激活,這可能導(dǎo)致了黑色素瘤對(duì)化療和一些分子靶向治療如BRAFV600E抑制劑的抵抗

2、。而對(duì)于能夠負(fù)向調(diào)控該信號(hào)通路的多磷酸肌醇-3-磷酸酶PTEN的缺失正是導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路在黑色素瘤中高活化的重要原因之一。然而對(duì)于與PTEN類似的具有脂質(zhì)磷酸酶活性的多磷酸肌醇-5-磷酸酶在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在通過(guò)鑒定一種多磷酸肌醇-5-磷酸酶分子-PIB5PA在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用并闡明其負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)的分子機(jī)制,為黑色素瘤的個(gè)體化治療提供一個(gè)新的分子靶點(diǎn),另外通過(guò)對(duì)P

3、IB5PA在黑色素瘤細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的探索,不僅為研究黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的思路,同時(shí)對(duì)下調(diào)PIB5PA表達(dá)的HDAC的鑒定將有益于發(fā)展更特異的HDAC抑制劑抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)。
　　方法:(1)分別采用免疫組化法、Westernblot以及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)黑色素瘤組織芯片、新鮮黑色素瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞以及黑色素瘤細(xì)胞系中PIB5PA,PTEN以及磷酸化Akt的表達(dá)水平。(2)選擇兩株極低表達(dá)PIB5PA以及

4、Akt高活化的黑色素瘤細(xì)胞系ME1007和Mel-FH瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PIB5PAcDNA以及建立攜帶可誘導(dǎo)表達(dá)PIB5PA基因系統(tǒng)的黑色素瘤亞細(xì)胞系(ME1007.PIB5PA和Mel-FH.PIB5PA),采用Westernblot檢測(cè)PIB5PA和磷酸化Akt的表達(dá),BrdU細(xì)胞增殖試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;通過(guò)在正常人黑色素細(xì)胞中knockdownPIB5PA以及PTEN,利用軟瓊脂克隆試驗(yàn)檢測(cè)黑色素細(xì)胞非

5、貼附性生長(zhǎng)情況;通過(guò)建立ME1007.PIB5PA細(xì)胞的裸鼠荷瘤模型,觀察4-OHT誘導(dǎo)PIB5PA表達(dá)對(duì)體內(nèi)黑色素瘤生長(zhǎng)的影響,明確PIB5PA在黑色素瘤生長(zhǎng)中的作用;在此基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)或knockdownPIB5PA的細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染myr-Akt或AktshRNA,檢測(cè)其對(duì)PIB5PA抑制細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)的逆轉(zhuǎn)效果,明確PIB5PA抑制黑色素瘤生長(zhǎng)的分子機(jī)制。(3)通過(guò)對(duì)PIB5PA和PTEN基因的單獨(dú)或雙重轉(zhuǎn)染,在血清饑餓狀

6、態(tài)下加以EGF誘導(dǎo),利用Westernblot檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞中Akt活化水平的改變,以及同時(shí)沉默PIB5PA和PTEN基因,利用軟瓊脂克隆試驗(yàn)檢測(cè)正常黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,以了解PIB5PA和PTEN在調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞PI3K/Akt通路中的作用關(guān)系。(4)通過(guò)對(duì)10株黑色素瘤細(xì)胞系PIB5PA基因外顯子的測(cè)序,實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)黑色素瘤細(xì)胞PIB5PA基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析,Westernblot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)DNA甲基化抑制劑5-

7、aza以及不同特異性的HDAC抑制劑分別作用黑色素瘤細(xì)胞前后PIB5PA的表達(dá)水平,初步明確PIB5PA在黑色素瘤下調(diào)表達(dá)的原因;通過(guò)對(duì)特異性HDAC的siRNAknockdown,利用westernblot檢測(cè)PIB5PA表達(dá)水平的變化確定黑色素瘤細(xì)胞中下調(diào)PIB5PA表達(dá)的HDAC;通過(guò)對(duì)PIB5PA基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行遞增式刪除構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和染色質(zhì)免疫沉淀試驗(yàn)明確HDAC通過(guò)SP1結(jié)合于PIB5

8、PA啟動(dòng)子區(qū)從而影響PIB5PA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)與正常痣組織和黑色素細(xì)胞相比,在黑色素瘤病理組織以及黑色素瘤細(xì)胞中PIB5PA的表達(dá)是明顯降低或缺失的,且與PTEN的表達(dá)呈一定的正關(guān)聯(lián)。(2)在黑色素瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PIB5PA能降低Akt的活化,抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖,而共轉(zhuǎn)染myr-Akt能逆轉(zhuǎn)其抑制作用;在正常黑色素細(xì)胞中knockdownPIB5PA能抑制Akt的活化,促進(jìn)黑色素細(xì)胞的非貼附性生長(zhǎng),而共

9、轉(zhuǎn)染AktshRNA卻能逆轉(zhuǎn)其促進(jìn)作用;外源性誘導(dǎo)PIB5PA在裸鼠荷瘤試驗(yàn)中抑制腫瘤的生長(zhǎng),而對(duì)ME1007.PIB5PA細(xì)胞感染myr-Akt慢病毒顆粒后能逆轉(zhuǎn)PIB5PA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。(3)撤除血清后,過(guò)表達(dá)PIB5PA能在EGF刺激下引起Akt磷酸化水平的一過(guò)性增高,而過(guò)表達(dá)PTEN僅顯示磷酸化Akt的整體水平的降低;在EGF刺激下,對(duì)黑色素瘤細(xì)胞同時(shí)過(guò)表達(dá)PIB5PA和PTEN能進(jìn)一步降低Akt的活化水平,而同時(shí)在兩株

10、相對(duì)高表達(dá)PIB5PA的黑色素瘤細(xì)胞中同時(shí)knockdownPIB5PA和PTEN則引起Akt的進(jìn)一步激活;相對(duì)于在正常黑色素細(xì)胞中僅knockdownPIB5PA或PTEN,雙重knockdownPIB5PA和PTEN形成的細(xì)胞克隆的體積明顯增大,而細(xì)胞克隆數(shù)卻有所減少。(4)盡管基因拷貝數(shù)降低可能造成一部分黑色素瘤細(xì)胞(<20%)中PIB5PA的低表達(dá),但是由HDAC2和-3引起的組蛋白低乙?；窃斐珊谏亓黾?xì)胞中PIB5PA下調(diào)表

11、達(dá)的一個(gè)重要因素。HDAC2和-3能通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子SP1作用于PIB5PA啟動(dòng)子區(qū)(-516/-116)進(jìn)而抑制PIB5PA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
　　結(jié)論:PIB5PA的下調(diào)表達(dá)所引起的黑色素瘤中PI3K/Akt信號(hào)通路被激活,以及與PTEN的協(xié)同作用,可能是造成黑色素瘤發(fā)生發(fā)展以及對(duì)化療產(chǎn)生抵抗的一個(gè)重要因素。組蛋白低乙?；种屏薖IB5PA在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá),其主要機(jī)制在于HDAC2和-3與轉(zhuǎn)錄因子Sp1形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體結(jié)合于