Cx26和Cx30縫隙連接通道對短單鏈核酸通透性的研究.pdf

1、目的：探討Connexin30(Cx30)和Connexin26(Cx26)組成的同型縫隙連接通道對短單鏈核酸的通透性，為研究Cx26及Cx30突變致聾的機制提供新的思路。
　　方法：（1）體外Cx26和Cx30縫隙連接的建立：提取pAAV-CMV-Cx26-GFP和pAAV-CMV-Cx30-GFP質(zhì)粒，測序后轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞建立體外Cx26和Cx30縫隙連接通道。為驗證體外建立通道有無功能，分別向未轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)

2、胞對以及表達(dá)Cx30和Cx26縫隙連接的細(xì)胞對的一側(cè)細(xì)胞顯微注射FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽，在注射后1min、5min、15min、20min、30min比較觀察對側(cè)細(xì)胞有無熒光。（2）同型Cx26和Cx30對單鏈脫氧核苷酸的通透性：用Cy3作為示蹤劑標(biāo)記12bp（序列為線蟲源性）單鏈DNA的5＇端，HPLC純化。將其分別顯微注射到轉(zhuǎn)染Cx30和Cx26縫隙連接的細(xì)胞對的一側(cè)細(xì)胞，在注射后1min、5min、15min、20min、30min

3、比較觀察對側(cè)細(xì)胞有無熒光。
　　結(jié)果：（1）質(zhì)粒測序結(jié)果為小鼠源性的Cx30和Cx26的cDNA。顯微注射FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽30min后，未轉(zhuǎn)染縫隙連接細(xì)胞對的非注射細(xì)胞未見紅色熒光。顯微注射FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽1min后，轉(zhuǎn)染表達(dá)Cx30和Cx26縫隙連接細(xì)胞對的非注射細(xì)胞可見紅色熒光。（2）顯微注射5＇Cy3標(biāo)記12bp單鏈脫氧核苷酸30min后,在觀察時間內(nèi)轉(zhuǎn)染表達(dá)Cx30和Cx26縫隙連接細(xì)胞對的非注射細(xì)胞未見紅色熒光。