Src-家族酪氨酸激酶在皮質(zhì)性白內(nèi)障發(fā)生中對縫隙連接蛋白Cx43的影響.pdf

1、研究背景：
　　前期研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的雞胚晶狀體皮質(zhì)性白內(nèi)障模型中，抑制Src-家族酪氨酸激酶(SFK)活性能有效阻止皮質(zhì)性白內(nèi)障的發(fā)生，這提示Src-家族酪氨酸激酶的異常激活可能參與皮質(zhì)性白內(nèi)障的發(fā)生，但其作用機理尚不清楚。在對腫瘤轉(zhuǎn)移的相關研究發(fā)現(xiàn)，SFK通過使縫隙連接蛋白Cx43相關位點磷酸化，從而抑制細胞間通過縫隙連接的通訊交通功能。晶狀體是一種無血管組織的器官，晶狀體上皮細胞和晶狀體表層纖維細胞間廣泛分布Cx43，它是

2、晶狀體實現(xiàn)離子、第二信使、代謝產(chǎn)物和水在細胞間迅速交換的結(jié)構(gòu)基礎，對保持晶狀體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持晶狀體透明至關重要。實驗性皮質(zhì)性白內(nèi)障是否通過SFK激活，影響了Cx43的表達、分布或功能，從而參與白內(nèi)障的發(fā)生是本研究關注的問題。
　　目的：
　　探討Src-家族酪氨酸激酶的異常激活在皮質(zhì)性白內(nèi)障的形成中對晶狀體縫隙連接蛋白Cx43的影響。
　　方法：
　　將胚胎10天(E10)的雞全晶狀體分離并培養(yǎng)在含10％FBS

3、的M199培養(yǎng)液中，共培養(yǎng)10天，以此作為對照組；在培養(yǎng)液中加入100nM/mlSrc-家族酪氨酸激酶特異性抑制劑PP1的晶狀體作為實驗組。隔日換液，并觀察、拍照記錄、測量晶狀體的混濁面積，計算晶狀體的混濁面積百分比。對培養(yǎng)第1、5和10天兩組晶狀體進行以下觀察：利用WGA和DAPI對晶狀體的冰凍切片進行細胞膜和細胞核進行免疫熒光染色，觀察晶狀體組織學改變；利用透射電鏡觀察的超微結(jié)構(gòu)變化；通過對縫隙連接蛋白Cx43的免疫熒光染色，觀察C

4、x43分布和表達量的變化；在晶狀體前囊膜上進行劃痕-染料負荷試驗，比較染料彌散距離，評價縫隙連接的功能的變化。分別采用蛋白免疫印跡法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應觀察Cx43在蛋白和核酸水平表達的變化。
　　結(jié)果：
　　對照組晶狀體在培養(yǎng)的10天里逐漸出現(xiàn)周邊部皮質(zhì)的混濁，混濁面積百分比在第4、10天分別26％和49％，而PP1處理組則為20％和14％，兩組間有顯著性差異(p<0.01)。第一天，兩組晶狀體的組織結(jié)構(gòu)和Cx43的表達

5、均沒有明顯變化；第5、10天對照組晶狀體上皮層與晶狀體纖維出現(xiàn)分離，晶狀體上皮細胞出現(xiàn)死亡，Cx43主要在晶狀體上皮細胞間表達；PP1處理后，不僅晶狀體上皮細胞間結(jié)合緊密，而且晶狀體上皮層與纖維之間緊密結(jié)合，細胞死亡明顯減少，Cx43的表達在上皮與纖維的交界面明顯增強。第10天，PP1組晶狀體上皮層保持正常結(jié)構(gòu)，Cx43的表達在前囊膜和上皮層之間也有增強。前囊膜的染料負荷試驗顯示，在第1、5、10天，對照組染料彌散距離分別為50.93±

6、13.19、66.67±7.29、99.52±12.67μm，而PP1組分別為89.54±9.60、69.18±5.49、130.63±10.52μm，第1、10天兩組間有顯著性差異(p<0.01)，PP1組縫隙連接的交通功能明顯增強。免疫印跡實驗結(jié)果顯示：在各時間點，PP1有效的抑制了SFK的活性，表現(xiàn)為活性Src(p-Src418)的表達降低(組間差異p<0.01)。以E10晶狀體為參照，晶狀體上皮中Cx43表達在D1的兩組中均有增

7、高，在D5的表達降低，與E10的表達強度相近，在D10時Cx43表達再次升高；兩組間Cx43表達在各時間點中，對照組均高于PP1處理組，在D1和D10兩組間差異明顯(p<0.01)。RT-PCR實驗結(jié)果顯示：兩組晶狀體上皮中Cx43在mRNA水平的表達均不高于E10對照組，兩組間各時間點PP1處理組Cx43的表達均低于對照組(p<0.05)，其中D5和D10時差異較大(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　抑制SFK的異常激活增