核黃素調(diào)節(jié)的活性氧信號(hào)影響植物防衛(wèi)反應(yīng)的初步研究.pdf

1、核黃素可通過生物合成、代謝與功能途徑的多個(gè)環(huán)節(jié)，尤其是黃素介導(dǎo)的氧化還原作用，影響植物防衛(wèi)和生長(zhǎng)發(fā)育。核黃素是一種新發(fā)現(xiàn)的植物抗病激發(fā)子，外源施用核黃素能夠誘導(dǎo)植物對(duì)多種病害的抗性，啟動(dòng)不同于其它已知的抗病信號(hào)通路，但其機(jī)制仍不清楚。核黃素參與植物抗氧化及過氧化過程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過敏反應(yīng)過程中活性氧的產(chǎn)生?；钚匝跏沁^敏性細(xì)胞壞死(hypersensitive cell death，HCD)的重要信號(hào)，能調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、抗病、抗蟲、

2、抗逆。另外，植物受不同誘導(dǎo)因子刺激后，迅速調(diào)動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制，一旦有病原物侵染，植物可以快速、有效地進(jìn)行防衛(wèi)發(fā)應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為“防御準(zhǔn)備過程(priming)”。本論文研究的目的是實(shí)驗(yàn)闡釋核黃素是否通過priming機(jī)制來誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)。 1、外源核黃素誘導(dǎo)的引發(fā)抗病防衛(wèi)反應(yīng)依賴過氧化氫和NPR1基因 近幾年的研究表明，priming可能是植物誘導(dǎo)抗性的重要機(jī)制。擬南芥用核黃素處理后，致病相關(guān)基因PR-1和PR-2表達(dá)量

3、明顯增加，但苯丙氨酸解氨酶基因PAL1表達(dá)水平無明顯變化。當(dāng)擬南芥先用核黃素處理，再接種丁香假單胞番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)時(shí)，細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)及防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)均比未處理時(shí)增強(qiáng)，同時(shí)誘發(fā)過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)的積累、胼胝質(zhì)沉積和過敏性細(xì)胞死亡。用過氧化氫清除劑(catalase，CAT)處理擬南芥完全消弱了植物細(xì)胞和分子水平的防衛(wèi)反應(yīng)及其對(duì)

4、病原菌的抗性。核黃素處理并接種病原菌時(shí)誘發(fā)的細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)在水楊酸(salicylic acid，SA)、乙烯(ethylene，ET)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和脫落酸(abscisic acid，ABA)信號(hào)通路的突變體上可以產(chǎn)生，但在npr1突變體中消失。研究結(jié)果表明，外施核黃素使植物進(jìn)入防御準(zhǔn)備狀態(tài)，接種病原菌后，植物體內(nèi)積累高濃度的過氧化氫，并激發(fā)細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)和相關(guān)基因的快速高強(qiáng)度表達(dá)以及對(duì)病原菌的抗性，這一過

5、程依賴于過氧化氫和NPR1基因，但不依賴于SA，ET、JA和ABA信號(hào)通路。 2、核黃素引發(fā)抗病防衛(wèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究 為了證明外施核黃素是否導(dǎo)致體內(nèi)氧化還原態(tài)的改變并且這一改變?cè)谝l(fā)抗病防衛(wèi)反應(yīng)中的作用，我們檢測(cè)了核黃素處理擬南芥5d內(nèi)的氧化還原動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在0h至Sd內(nèi)，外源核黃素處理激發(fā)植物體內(nèi)的ROS積累且在2h達(dá)到高峰值，Sd后恢復(fù)到原來水平；我們通過3，3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzine，D

6、AB)染色、H2O2含量測(cè)定、百草枯(paraquat，PQ)敏感性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)擬南芥經(jīng)核黃素處理后體內(nèi)氧化還原態(tài)改變，氧化態(tài)升高。植物噴施核黃素后再注射CAT，植物體內(nèi)氧化態(tài)降低；而且5d后接種p.syringae pv. tomato DC3000，植物體內(nèi)沒有出現(xiàn)細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)，其抗病性與噴施核黃素植株相比顯著降低，這表明，核黃素處理擬南芥后導(dǎo)致的還原狀態(tài)的改變對(duì)核黃素誘導(dǎo)抗病性是必需的。 3、FAO在擬南芥抗病防衛(wèi)反應(yīng)中的作

7、用 含黃素的長(zhǎng)鏈脂肪醇氧化酶(FAO)最初從假絲酵母中純化得到。這種酶結(jié)合在膜上，包含黃素，且與過氧化氫產(chǎn)生相關(guān)。過氧化氫是植物體內(nèi)活性氧的主要形式之一。研究表明，植物抗病過程中產(chǎn)生的活性氧對(duì)植物抵御病原菌的侵染具有重要的意義。植物能識(shí)別入侵的病原菌，并啟動(dòng)體內(nèi)一系列的防御性反應(yīng)，將入侵物限制在特定位點(diǎn)，從而使植物免受更大的侵害。為了解析FAO在擬南芥抗病防衛(wèi)反應(yīng)中的作用，我們使用野生型擬南芥及fao3突變體進(jìn)行試驗(yàn)。通過葉片過

8、氧化氫含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)fao3突變體植株中的活性氧水平比野生型植株低；噴施ROS供體百草枯后，突變體植物對(duì)百草枯不夠敏感，這表明突變體植物體內(nèi)的氧化還原平衡被打破(具有較低的氧化態(tài))。為了解析突變體植物抗病性與氧化還原平衡改變的關(guān)系，我們通過接種p.syringae pv. tomato DC3000，對(duì)抗病性表型和菌落生長(zhǎng)曲線進(jìn)行觀測(cè)，并檢測(cè)了兩種植物體內(nèi)的ROS水平。結(jié)果表明，F(xiàn)AO與過氧化氫產(chǎn)生相關(guān)，突變體植物體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)改變