植物控制核黃素合成及相關氧化還原反應的三個關鍵基因的克隆及其功能的初步研究.pdf

1、核黃素在生物體內形成黃素單核苷酸FMN及黃素腺嘌呤二核苷酸FAD，它們是黃素酶的輔酶。核黃素所形成的輔酶參與機體組織維生素C抗氧化作用的呼吸電子傳遞及氧化還原過程，參與植物抗氧化及過氧化過程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過敏反應過程中活性氧中間體(ROIs)的產生，而ROIs是過敏細胞壞死的重要信號，能調節(jié)生長、抗病、抗蟲、抗逆，所以核黃素與植物免疫反應有關。核黃素在植物和微生物中都能自我合成，合成途徑的倒數(shù)第二步是由2,4-二氧四氫喋啶合

2、酶(lumazine synthase，LS)催化的，最后一步是由核黃素合酶(riboflavin synthase，RS)催化的。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)LS與茉莉酸途徑相交叉，與根對茉莉酸的敏感性、植物的抗病性密切相關。由此可推斷水稻上的OsLS和OsRS很可能存在著許多不為所知的功能，在植物上關于編碼這兩個酶的基因的報道不多，尤其是水稻的這兩個基因目前還沒有得到克隆。 本實驗室首次從水稻中克隆到核黃素合成過程的倒數(shù)第二步和最后一步關

3、鍵酶的編碼基因OsLS和OsRS：OsLS基因全長666 bp，在氨基酸序列上與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、菠菜(Spinacia oleracea)和煙草(Nicotiana tabacum)的LS基因的同源性非常高。系統(tǒng)進化關系分析表明，在同一個進化分枝內。OsRS序列全長1662bp，與Gene ID OJ1111H02.Predgene04的不合內含子和非翻譯區(qū)的序列完全一致。原核表達LS和RS蛋白質，能

4、分別得到包括His-tag在內的29.85 kD和66.37 kD大小的OsLS和OsRS蛋白質，分子大小與預期一致。以100μg/ml水稻細條斑病菌的激發(fā)子蛋白質HpaG<,Xoo>做陽性對照，不同濃度的OsLS和OsRS蛋白質溶液注射煙草葉片，結果表明不能引發(fā)煙草葉片的過敏反應(hypersensitive response，HR)，表明上述兩種蛋白質在煙草上的反應不同于HpaG<,Xoo>激發(fā)子。本研究利用相關軟件分析了兩種蛋白的

5、生化特性、亞細胞定位和高級結構。 作者將克隆到的OsLS和OsRS連接到了植物表達載體pBI121上，測序證明構建好的質粒序列是正確的，然后在農桿菌的介導下，通過Horsch葉盤法將連有OsLS和OsRS的表達載體轉化到了煙草上。根據pBI121上攜帶的卡那霉素抗性基因初步篩選到了陽性的轉基因煙草植株。通過PCR和Southern雜交方法證明OsLS和OsRS基因已經整合到了煙草的染色體上，RT-PCR結果表明轉化的OsLS和O

6、sRS基因在轉基因植物中能夠高效表達。由于啟動SA、JA和乙烯信號通路的激發(fā)子均可刺激核黃素合成基因表達，使核黃素含量提高，同時它們與核黃素一樣均誘導對細菌的抗性，因此核黃素在組織內的含量變化可能影響抗病防衛(wèi)基本信號通路。本研究對篩選得到的陽性轉基因煙草植株進行了測定，結果表明，相對于轉空載體煙草植株，OsLS和OsRS轉基因煙草中游離態(tài)的核黃素、FAD和FMN含量都有所升高，同時，觀測表明，分別表達OsLS和OsRS的轉基因煙草植株發(fā)

7、生了種子萌發(fā)速度、株高等多種生長表型改變。這些結果為研究核黃素含量對植物抗病防衛(wèi)和生長發(fā)育信號傳導的調控提供了依據，OsLS和OsRS轉基因煙草材料的產生為后續(xù)的研究奠定了基礎。 硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)是一種小分子量蛋白質，催化巰基．二硫鍵的交換反應，參與細胞還原環(huán)境的調節(jié)，廣泛存在于植物的各種組織和器官內，在新陳代謝中有重要作用，如消除氧脅迫、參入蛋白質的轉錄和翻譯。本研究從煙草中克隆了硫氧還蛋白基因Nt

8、TRX-hl，并推導出NtTRX-hl的氨基酸序列。系統(tǒng)進化關系分析表明，NtTRX-hl與小麥、大麥、擬南芥等多種植物的TRX蛋白有很高的同源性。構建高效表達載體，誘導表達重組菌得到分子大小為22.3kDa的融合蛋白，與推測的分子量一致。用胰島素和二硫蘇糖醇作底物進行酶活性測定，結果表明NtTRX-hl具有活性。軟件分析了NtTRx-hl蛋白的生化參數(shù)和亞細胞定位，預測了該蛋白的高級結構。這些工作為進一步探討NtTRX-hl的功能奠定