羥基紅花黃色素A通過PI3K-Akt-Hexokinase Ⅱ途徑在缺氧-復氧誘導的H9c2心肌細胞損傷中的保護機制研究.pdf

1、第一部分：（HydroxysaffloryellowA,HYSA)對H9c2心肌細胞的活力影響
　　目的：
　　冠脈介入治療、冠脈搭橋和冠脈溶栓等治療手段是目前臨床心臟相關疾病治療的主要手段，但是伴隨而來的是該類手術術后易導致的心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷的出現(xiàn)，而造成的二次損傷嚴重影響患者健康。HYSA是黃酮類物質(zhì)，中藥紅花中的主要活性成分，其對血管組織細

2、胞損傷具有明顯的保護作用，但HYSA在缺血再灌注損傷中的保護作用還有待研究。
　　方法：
　　本實驗釆用H9c2心肌細胞培養(yǎng)體系，建立缺氧/復氧（Hypoxia/reoxygenation H/R）心肌損傷模型，通過MTT實驗首先考察HYSA對心肌細胞的存活率的影響；在此基礎上，檢測細胞乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），丙二醛

3、（Methane dicarboxylic aldehyde，MDA）含量，考察HYSA對細胞存活率及氧化應激損傷的影響；同時給于PI3K，HKII，ERK抑制劑考察給予抑制劑后HSYA對H/R H9c2細胞模型的影響。
　　結果：
　　1.與正常組比較，H/R細胞模型組細胞存活率明顯降低，給于模型細胞不同劑量的HSYA后，隨著給藥劑量的增高，表現(xiàn)出明顯的保護作用。
　　2.與正常組相比較，當給于PI3K抑制劑LY29

4、4002或HKII抑制劑3-BrPA后，HSYA保護作用明顯降低，與未給予抑制劑具有顯著差異。而給于ERK抑制劑后，其對HSYA的心肌細胞保護作用影響較弱，但與單一給于HSYA干預組無顯著差異。
　　3.與正常組相比較，模型組細胞LDH顯著升高，說明細胞線粒體損傷明顯增加，給于HYSA后LDH顯著下降與模型組具有顯著差異；但是當給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrP后，HSYA保護作用顯著降低，而給于ERK抑

5、制劑后，其對HSYA的心肌細胞保護作用雖有所抑制，但與單一給于HSYA干預組沒有顯著差異。
　　4.與正常組相比較, H/R細胞模型組細胞SOD顯著降低，MDA顯著升高，說明細胞氧化應激反應明顯增加。給于模型細胞HSYA后表現(xiàn)出明顯的保護作用，顯著升高SOD并降低MDA含量與模型組具有顯著差異。但是當給于PI3K抑制劑LY294002及HKII抑制劑3-BrPA后，HSYA改善細胞氧化應激反應的作用明顯降低；而給于ERK抑制劑后，

6、其對HYSA的心肌細胞保護作用有所抑制，但與單一給于HSYA干預組沒有顯著差異。
　　第二部分：HYSA對H9c2心肌細胞線粒體及能量代謝的影響
　　目的：
　　線粒體在MIRI中起關鍵性作用。線粒體是細胞能量的供應器， MIRI發(fā)生時，氧化應激反應可導致細胞線粒體功能紊亂，影響線粒體正常能量供應，降低ATP合成；同時氧化應激反應可以引起線粒體中細胞色素C的釋放，繼而激活caspase3，觸發(fā)細胞凋亡的發(fā)生，HYSA在

7、H9c2心肌細胞H/R模型中具有一定保護作用可改善氧化應激反應，對于細胞線粒體功能是否具有保護作用有待考察。
　　方法：
　　本研究通過考察H9c2細胞ATP含量，胞漿及線粒體中細胞色素C含量的變化，考察HSYA對H/R H9c2細胞線粒體的保護作用，同時通過考察細胞中caspase3活性及采用Annexin-V-FITC雙染考察細胞凋亡，評價HYSA在細胞凋亡中干預作用。
　　結果：
　　1.與正常組相比較，H

8、/R細胞模型組細胞ATP含量顯著降低；給于模型細胞HYSA可使ATP顯著升高與模型組具有顯著差異；同時給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrPA后，ATP明顯降低與單一HSYA干預組具有顯著差異；而給于ERK抑制劑后，與單一給于HSYA干預組沒有顯著差異。
　　2.與正常組相比較，H/R細胞模型組的細胞胞漿中細胞色素C含量顯著升高，線粒體中細胞色素C含量明顯降低；給于模型細胞HSYA后，可以明顯降低胞漿中的細胞

9、色素C含量，升高線粒體中含量，表現(xiàn)出明顯的保護作用。給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrPA后， HSYA保護作用明顯降低，胞漿中細胞色素C含量較HYSA組明顯升高，線粒體中細胞色素C含量降低，與HYSA組具有顯著性差異。而給于ERK抑制劑后，與單一給于HSYA干預組沒有顯著差異。
　　3.與正常組相比較，H/R細胞模型組細胞Caspase3含量顯著升高；給于模型細胞HSYA后，Caspase3含量顯著降低與

10、模型組具有顯著差異；同時給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrPA后，HSYA保護作用明顯降低，Caspase3含量明顯升高與HYSA組具有顯著差異；給于ERK抑制劑后，與單一給于HSYA干預組沒有顯著差異。
　　4.與正常組相比較，H/R細胞模型組細胞凋亡顯著升高；給于模型細胞HSYA后細胞凋亡明顯降低，與模型組具有顯著差異；同時給于PI3K抑制劑LY294002或HKII抑制劑3-BrPA后，凋亡明顯升高，

11、HSYA抑制凋亡作用明顯降低；但給于ERK抑制劑后，與單一給于HSYA干預組相比影響較小。
　　第三部分：HYSA對H9c2心肌細胞Akt，GSk-3β，HexokinaseII的影響
　　目的：
　　磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-oh kinase，PI3K)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)

12、兩個信號通路合稱為再灌注損傷挽救激酶信號通路。兩個途徑均參與心臟缺血再灌注損傷的保護作用。PI3K/Akt及ERK均可以促進GSK-3β磷酸化，從而降低線粒體ATP的消耗，減少ROS的生成。HKII是糖酵解關鍵限速酶，可通過PI3K/Akt信號通路調(diào)控，Akt磷酸化可激活的HKII與線粒體結合，保護線粒體功能。我們研究發(fā)現(xiàn)HYSA對缺血再灌注損傷具有保護作用，但在給于PI3K，ERK，HKII抑制劑下其保護作用不同。本研究將考察HYSA

13、對細胞中PI3K，ERK，HKII途徑的影響。
　　方法：
　　本研究將通過建立H/R H9c2細胞，通過給于HYSA及不同抑制劑，采用Western blot法分別檢測細胞p-Akt，p-GSK-3β，HKⅡ蛋白含量考察HYSA對RISK途徑及HK途徑的調(diào)控作用。
　　結果：
　　1.與正常組相比較，H/R細胞模型組細胞胞漿中p-Akt有所升高；給于模型細胞HSYA后，細胞中p-Akt含量顯著升高，與模型組具有

14、顯著差異。同時給于PI3K抑制劑LY294002后，p-Akt含量較明顯降低，PI3K抑制劑LY294002明顯降低了HYSA對細胞p-Akt的誘導作用。
　　2.與正常組相比較，H/R細胞模型組細胞胞漿中p-GSK-3β有所升高；給于模型細胞HYSA后，細胞中GSK-3β含量有所升高，與模型組具有顯著差異。但與其對Akt的激活作用明顯較弱，同時給于ERK抑制劑 PD98059后，GSK-3β含量明顯降低，ERK抑制劑PD9805

15、9明顯降低了HYSA對細胞p-GSK-3β的誘導作用。
　　3.與正常組相比較，H/R細胞模型組細胞中HKII顯著降低；但給于模型細胞HYSA后，細胞中HKII含量顯著升高，與模型組及空白組具有顯著差異。同時給于HKII抑制劑3-BrPA后，HKII含量明顯降低，HKII抑制劑3-BrPA明顯降低了HSYA對細胞HKII的誘導作用。
　　結論：
　　1.在H/R細胞模型中，HYSA對細胞具有明顯保護作用并呈濃度依賴性。

16、
　　2.HYSA可顯著降低細胞氧化應激水平，減少細胞中細胞色素C、caspase3的水平和細胞凋亡，同時恢復線粒體能量代謝。
　　3.PI3K抑制劑預處理（LY294002）或給于HKII抑制劑（3-BrPA）， HYSA的保護作用明顯減弱。相反，ERK抑制劑（PD98059）預處理，對HYSA的心肌細胞保護作用影響不顯著。
　　4.ERK通過磷酸化GSK3-β發(fā)揮心肌保護作用，但HYSA對GSK3-β磷酸化效果較弱