理氣化痰活血方和益氣養(yǎng)陰清熱方調(diào)節(jié)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、目的：通過(guò)觀察理氣化痰活血方（以下簡(jiǎn)稱W1）及其三個(gè)拆方理氣方（以下簡(jiǎn)稱LQ）、清熱方（以下簡(jiǎn)稱QR）、活血方（以下簡(jiǎn)稱HX）和益氣養(yǎng)陰清熱方（以下簡(jiǎn)稱W2）及其拆方益氣方（以下簡(jiǎn)稱YQ）、養(yǎng)陰方（以下簡(jiǎn)稱YY）、清熱方（以下簡(jiǎn)稱 QR）對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞 TPC-1增殖抑制和EGFR—PLC-γ1—P-tyr—PKC-α與 TSHR—PLC-β3—PI3K—PKCα信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，研究理氣化痰活血和益氣養(yǎng)陰清熱治療甲狀腺癌的機(jī)

2、理，探討氣滯、痰凝、血瘀、熱毒、氣陰兩虛等與甲狀腺癌變和EGFR—PLC-γ1—P-tyr—PKCα與TSHR—PLC-β3—PI3K—PKCα信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系。
　　方法：采用頻數(shù)分布分析、主成分分析、聚類分析等數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行中醫(yī)診治甲狀腺瘤和癌的證候和方藥分析與規(guī)律探討；以人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，MTT法測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞抑制率，篩選出明顯抑制甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1增殖的有效藥物；

3、運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選出療效最佳方劑組合；分別設(shè)對(duì)照組、理氣化痰活血方及三個(gè)拆方、益氣養(yǎng)陰清熱方及三個(gè)拆方處理細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察TPC-1細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)改變；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定理氣化痰活血方及其拆方和益氣養(yǎng)陰清熱方及其拆方對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1周期的影響；運(yùn)用Western blot法檢測(cè)各藥物組對(duì) TPC-1細(xì)胞 EGFR—PLC-γ1—P-tyr—PKCα和TSHR—PLC-β3—PI3K—PKCα信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各蛋

4、白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：①文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析得中醫(yī)辨證論治甲狀腺瘤和癌涉及證型32個(gè)，其中氣滯痰凝血瘀、肝郁氣滯、氣陰兩虛、痰濕凝滯、痰熱互結(jié)、肝郁脾虛為主要證型；病機(jī)要素13個(gè)，其中實(shí)證9個(gè)，以氣滯、痰凝、血瘀、火熱為主，虛證4個(gè)，以氣虛和陰虛為主；臟腑病位6個(gè)，主要為肝、脾、腎、心；得156個(gè)癥狀和體征，癥狀聚類分析得6個(gè)聚類證型，分別為肝氣郁滯、脾虛痰凝、痰熱互結(jié)、氣陰兩虛、氣滯血瘀、肝郁化火；涉及方劑396首，其中成方56首，

5、自擬方340首，成方多用和解劑、補(bǔ)益劑、祛痰劑；中藥289味，按功能分為19大類，其中化痰止咳平喘藥、清熱藥、補(bǔ)虛藥、活血化瘀藥、理氣藥、平肝息風(fēng)藥使用頻率較大，藥物歸經(jīng)主要在肝、肺、脾、胃、腎、心等。②理氣化痰活血方及其拆方和益氣養(yǎng)陰清熱方及其拆方均明顯抑制TPC-1細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞形態(tài)作用與正常對(duì)照相比明顯不同。理氣化痰活血方理氣組細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形；化痰組細(xì)胞皺縮，成梭形或圓形，表面粗糙，胞內(nèi)充滿大量顆粒狀或空泡樣物質(zhì)；活血組細(xì)胞數(shù)目明

6、顯減少，細(xì)胞明顯皺縮變小，透光度減低，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙加大，貼壁性變差；全方組可見(jiàn)細(xì)胞皺縮，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞表面粗糙，多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞碎片增多（見(jiàn)附圖1-15）。益氣養(yǎng)陰清熱方益氣組細(xì)胞皺縮變小，呈圓形或梭形，細(xì)胞表面粗糙，有較多細(xì)胞碎片；養(yǎng)陰組細(xì)胞變圓或梭形，部分細(xì)胞疏松膨脹，細(xì)胞間隙加大，胞內(nèi)充滿大量顆粒狀或空泡樣物質(zhì)；清熱組細(xì)胞明顯變圓，疏松膨脹，細(xì)胞表面粗糙，邊緣呈空泡樣結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)充滿顆粒狀物質(zhì)；全方組細(xì)胞形態(tài)呈

7、不規(guī)則梭形或圓形，細(xì)胞表面粗糙，多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)充滿顆粒狀物質(zhì)，有大量細(xì)胞碎片（見(jiàn)附圖16-30）。③理氣化痰活血方及其拆方和益氣養(yǎng)陰清熱方及其拆方均能抑制TPC-1細(xì)胞生長(zhǎng)，全方作用最強(qiáng)，隨藥物濃度、時(shí)間的增加，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)、時(shí)間—效應(yīng)依賴關(guān)系。④理氣化痰活血方及其拆方和益氣養(yǎng)陰清熱方及其拆方均對(duì) TPC-1細(xì)胞周期有明顯影響，理氣化痰活血方各治法組G1期細(xì)胞百分比均降低，其中全方組降低最為顯著，G2期細(xì)胞

8、百分比均明顯增加，其中全方組增加最多。益氣養(yǎng)陰清熱方各治法組 G1期細(xì)胞百分比均降低，其中養(yǎng)陰組降低最為顯著；S期養(yǎng)陰組細(xì)胞百分比升高；G2期各加藥組細(xì)胞百分比均明顯增加，其中養(yǎng)陰組增加最多。結(jié)果表明理氣化痰活血方和益氣養(yǎng)陰清熱方均將細(xì)胞阻滯于 G2期，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。⑤人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞 TPC-1可以檢測(cè)到EGFR、PLC-γ1、P-tyr、PKCα和TSHR、PLC-β3、PI3K蛋白分子不同程度的過(guò)表達(dá)。⑥當(dāng)用IC50藥物劑

9、量處理細(xì)胞時(shí)，理氣化痰活血方及其拆方和益氣養(yǎng)陰清熱方及其拆方均能下調(diào) EGFR—PLC-γ1—P-tyr—PKCα和TSHR—PLC-β3—PI3K—PKC-α信號(hào)通路各蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：①理氣化痰活血方各治療組和益氣養(yǎng)陰清熱方各治療組均能明顯抑制人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1的增殖，且均以全方組效果最好；理氣、化痰、活血三法連用，或益氣、養(yǎng)陰、清熱三法連用均具有協(xié)同作用。②理氣化痰活血方和益氣養(yǎng)陰清熱方均將TPC-1細(xì)胞

10、阻滯于G2期，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。③甲狀腺癌發(fā)病與EGFR—PLC-γ1—P-tyr—PKCα和TSHR—PLC-β3—PI3K—PKC-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)密切相關(guān)。④理氣化痰活血方及其拆方和益氣養(yǎng)陰清熱方及其拆方通過(guò)不同程度抑制 TPC-1細(xì)胞EGFR—PLC-γ1—P-tyr—PKCα和TSHR—PLC-β3—PI3K—PKC-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各蛋白表達(dá)水平發(fā)揮抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖的作用。⑤通過(guò)藥效反證，在甲狀腺癌病變中,氣滯、痰凝、血瘀、熱毒