清熱養(yǎng)陰解毒方及拆方調(diào)節(jié)人食管癌細胞 EC9706---PDGFRα-PLC-γ1-PKCα---介導的信號研究.pdf

1、　　目的：通過觀察清熱養(yǎng)陰解毒方及三個拆方清熱方(以下簡稱Q)、養(yǎng)陰方(以下簡稱Y)、解毒方(以下簡稱J)對人食管鱗癌細胞EC9706增殖的抑制和采用流式細胞儀技術(shù)檢測全方及拆方觀察細胞周期變化，及各方對PDGFRα、PLC-γ1、PKCα蛋白的表達，研究清熱、養(yǎng)陰、解毒及全方治療食管鱗癌的作用機理，探討熱、燥、毒與食管鱗癌病變的關(guān)系。
　　方法：本實驗以人食管鱗癌細胞EC9706為實驗對象，醇提的中藥用100μg/ml濃度作

2、用于細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況，以MTT法計算出藥物對細胞作用的抑制率，從候選藥中篩選出抑制食管鱗癌細胞生長最好的中藥。優(yōu)選出療效最佳組方；設(shè)陰性對照組和清熱養(yǎng)陰解毒方及三個拆方處理細胞，檢測不同組方對人食管鱗癌細胞EC9706的量效和時效關(guān)系，顯微鏡下觀察細胞EC9706生長狀態(tài)及形態(tài)改變；PI 單染標記流式細胞術(shù)檢測清熱養(yǎng)陰解毒方及其拆方對EC9706 細胞周期的影響；采用 Western blot 檢測各藥物組對細胞 E

3、C9706 中PDGFRα、PLC-γ1、PKCα蛋白表達的影響。
　　結(jié)果：①MTT實驗結(jié)果顯示，從中藥中篩選出抑制率大于37%的6種藥物；優(yōu)選出最佳組方，再設(shè)陰性對照組，清熱組，養(yǎng)陰組，解毒組及全方組(不同濃度)處理細胞。清熱養(yǎng)陰解毒方及三個拆方對細胞EC9706的增殖明顯抑制，影響其形態(tài)特征。倒置顯微鏡下觀察，對照組細胞貼壁生長，呈梭形，兩端圓鈍而不尖銳，細胞呈鑲嵌或腺泡狀排列，邊界清楚，胞漿少，折光度良好，核分裂相多見

4、，含粘液空泡及顆粒；清熱組細胞疏松膨脹，間隙加大，呈圓球形，貼壁性變差，皿中視野可見有許多細胞碎片；養(yǎng)陰組可見細胞縮小皺縮，透光度減低，形態(tài)不規(guī)則，細胞間基質(zhì)呈現(xiàn)絲網(wǎng)狀，貼壁性變差，細胞碎片增多；解毒組細胞表面粗糙，胞內(nèi)充滿大量顆粒狀或空泡樣物質(zhì) ，皿中視野可見有細胞碎片，并可見漂浮發(fā)亮的圓形細胞；全方組及其它各拆方組細胞表面粗糙，數(shù)目減少，部分細胞變圓、縮小，停止分裂增殖；細胞間隙增大，邊界清楚；皿中大部分細胞變成碎片；②清熱、養(yǎng)陰、

5、解毒及全方均能抑制EC9706細胞生長，且全方組作用最強。各組隨藥物濃度、時間的增加，抑制率逐漸增強，呈量效、時效依賴關(guān)系。而且伴隨著濃度增高，抑制率呈增加趨勢，藥物濃度為200μg/ml時抑制率最高；③流式細胞儀檢測細胞周期分布顯示：G1/G0：和陰性組比較，各藥物組的細胞比率都明顯增高(P<0.05)；各拆方組與全方組比較，細胞比率明顯降低(P<0.05)。S 期：和陰性組比較，全方組和養(yǎng)陰組細胞比率降低明顯(P<0.05)；各拆方

6、組的細胞比率比全方組的細胞比率升高明顯(P<0.05)。G2/M期：和陰性對照組比較，細胞比率降低明顯(P<0.05)。④Western blot分析發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，當用IC50藥物濃 度作用細胞時，清熱、養(yǎng)陰、解毒及其全方均能下調(diào) PDGFRα、PLC-γ1、PKCα蛋白表達的水平，其作用強弱依次為：全方組>解毒組>清熱組>養(yǎng)陰組。
　　結(jié)論：①全方及各拆方均能抑制EC9706細胞的生長；全方組療效最明顯，表明清熱、

7、養(yǎng)陰、解毒藥配伍具有協(xié)同作用，其抑制作用呈劑量-時間-效應關(guān)系；并能顯著影響人食管癌細胞EC9706的細胞形態(tài)；②全方組及其拆方組對EC9706細胞周期各時相均有影響，主要是通過抑制細胞的DNA合成前期和DNA合成期，即將細胞阻滯于G1/G0期，部分阻滯于S期和G2/M期，且有顯著的濃度依賴性，從而抑制細胞增殖達到抗腫瘤作用；③全方組及拆方通過抑制食管鱗癌細胞增殖與下調(diào)PDGFRα、PLC-γ1和PKCα蛋白表達水平來抑制食管鱗癌細胞增