清熱化痰方及其拆方調節(jié)人食管癌細胞PLC介導的生長信號轉導的研究.pdf

1、目的：
　　從臨床治療食管癌531味藥物中篩選對 TE-1、EC9706、EC109三種食管癌細胞最佳生長抑制中藥，通過觀察最佳抑制藥物穿山龍、土貝母、皂角、重樓正丁醇萃取部位所組成的清熱化痰方及其拆方對人食管癌細胞 TE-1、EC9706、EC109增殖抑制作用、細胞周期和EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ERK與 PLCε1—p53—NFkB信號轉導通路的影響，研究清熱化痰方治療食管癌的機理，探討食管癌中醫(yī)病機相關信號分子，

2、以期揭示食管癌中醫(yī)分子病機，為臨床治療食管癌提供有效方藥。
　　方法：
　　備選中藥采用醇提法制備藥物，以人食管癌細胞 TE-1、EC9706、EC109為實驗對象，MTT法測定備選藥物對各細胞增殖的抑制率，從531味藥物中篩選出對人食管癌細胞 TE-1、EC9706、EC109、三種細胞株增殖都有明顯抑制作用的藥物（穿山龍、重樓、皂角和土貝母）；對穿山龍、重樓、皂角和土貝母四味中藥醇提物分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、和水萃

3、取，得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、和水萃取部位；用MTT法分別檢測穿山龍、重樓、皂角和土貝母四味中藥氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、和水萃取部位對人食管癌細胞 TE-1、EC9706、EC109增殖的影響，篩選出抑制細胞作用最明顯的萃取部位，組成清熱化痰方，測定清熱化痰方及其拆方對人食管癌三種細胞作用的量效關系；倒置熒光顯微鏡觀察清熱化痰方及其拆方對人食管癌細胞 TE-1、EC9706、EC109形態(tài)的影響；運用流式細胞術測定清熱化痰方及其拆方對

4、人食管癌細胞 TE-1、EC9706、EC109細胞周期的影響；運用 Werstern-blot法檢測清熱化痰方及其拆方對人食管癌 TE-1、EC9706、EC109細胞EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ERK與 PLCε1—p53—NFkB信號轉導通路各蛋白表達的影響。
　　結果：
　　1、從531味中藥中篩選出最佳抑制三種食管癌細胞生長的穿山龍、重樓、皂角和土貝母四種中藥。
　　2、用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水分

5、部提取穿山龍、重樓、皂角和土貝母四種中藥，篩選出四種中藥最佳抑制三種食管癌細胞生長的正丁醇有效部位。
　　3、用穿山龍、重樓、皂角和土貝母四種中藥正丁醇有效部位組成的清熱化痰方及拆方皆能明顯抑制人食管癌 TE-1、EC9706、 EC109三種細胞的增殖，且以清熱化痰方全方組作用最為明顯。
　　4、、清熱化痰方及其拆方對食管癌 TE-1、EC9706、 EC109三種細胞生長皆有很強的抑制作用，其中全方作用最強，并隨藥物濃度

6、和藥物作用時間，對細胞生長抑制呈現(xiàn)劑量—效應依賴關系和時間—效應依賴關系。
　　5、清熱化痰方及其拆方對TE-1、EC9706、 EC109細胞周期均有明顯影響，其中對TE-1細胞：與空白對照組比較，清熱組、化痰組和全方組G1期細胞百分比均有所下降，其中全方組下降最顯著； S期各治療組細胞百分比顯著增加，其中化痰組增加最為明顯，抑制強弱依次為化痰組>全方組>清熱組，G2期細胞百分比無明顯變化；對EC9706細胞：與空白對照組比較，

7、清熱組、化痰組和全方組G1期細胞百分比均無明顯變化；S期各治療組細胞百分比有所下降，其中全方組下降最為明顯，G2期各治療組細胞百分比明顯升高，其中全方組升高最明顯，抑制強弱依次為全方組>清熱組>化痰組；對EC109細胞：與空白對照組比較，清熱組、化痰組和全方組G1期細胞百分比均有所降低；S期各治療組細胞百分比顯著升高，其中全方組升高最為明顯,抑制強弱依次為全方組>清熱組>化痰組，G2期各治療組細胞百分無明顯變化。
　　6、人食管癌

8、 TE-1、EC9706、 EC109三種細胞皆可以檢測到 EGFR、PLC-γ1、PKC-α、ERK、PLCε1及 NFkB蛋白分子不同程度的過表達和p53蛋白分子的低表達。
　　7、當用 IC50藥物劑量處理細胞時，清熱化痰方及其拆方各治療組均能下調食管癌 TE-1、EC9706、 EC109三種細胞 EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ER K信號通路各蛋白表達水平，同時可以下調 PLCε1—p53—NFkB信號通路中PLC

9、ε1和NFkB各蛋白表達水平、提高p53蛋白表達水平。
　　結論：
　　1、清熱化痰組、清熱組、化痰組均能明顯抑制人食管癌細胞 TE-1、EC9706、EC109的增殖，且均以清熱化痰全方組效果最好；清熱、化痰二法連用具有協(xié)同作用。
　　2、清熱化痰方作用于 TE-1細胞：清熱化痰方及其拆方對 TE-1細胞周期有明顯影響，并且清熱化痰方及其拆方各治療組藥物主要將細胞阻滯于S期，從而抑制人食管癌 TE-1細胞的增殖;清熱

10、化痰方作用于 EC9706細胞：清熱化痰方及其拆方對 EC9706細胞周期有明顯影響，并且清熱化痰方及其拆方各治療組藥物主要將細胞阻滯于 G2期，從而抑制人食管癌EC9706細胞的增殖；清熱化痰方作用于 EC109細胞：清熱化痰方及其拆方對 EC109細胞周期有明顯影響，并且清熱化痰方及其拆方各治療組藥物主要將細胞阻滯于 S期，從而抑制人食管癌 EC109細胞的增殖。
　　3、食管癌發(fā)病與 EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ER

11、K與 PLCε1—p53—NFkB信號轉導通路中EGFR、PLC-γ1、PKC-α、ERK、PLCε1及 NFkB的表達增強和p53的表達減弱密切相關。
　　4、清熱化痰方通過不同程度抑制 TE-1、EC9706、EC109細胞 EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ERK與 PLCε1—p53—NFkB信號轉導通路中EGFR、PLC-γ1、PKC-α、ERK、PLCε1及 NFkB蛋白的表達水平，同時升高p53的表達量，從而發(fā)揮其