清熱化痰方及其拆方調(diào)節(jié)人食管癌細(xì)胞PLC介導(dǎo)的生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、目的：
　　從臨床治療食管癌531味藥物中篩選對(duì) TE-1、EC9706、EC109三種食管癌細(xì)胞最佳生長(zhǎng)抑制中藥，通過(guò)觀察最佳抑制藥物穿山龍、土貝母、皂角、重樓正丁醇萃取部位所組成的清熱化痰方及其拆方對(duì)人食管癌細(xì)胞 TE-1、EC9706、EC109增殖抑制作用、細(xì)胞周期和EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ERK與 PLCε1—p53—NFkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，研究清熱化痰方治療食管癌的機(jī)理，探討食管癌中醫(yī)病機(jī)相關(guān)信號(hào)分子，

2、以期揭示食管癌中醫(yī)分子病機(jī)，為臨床治療食管癌提供有效方藥。
　　方法：
　　備選中藥采用醇提法制備藥物，以人食管癌細(xì)胞 TE-1、EC9706、EC109為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，MTT法測(cè)定備選藥物對(duì)各細(xì)胞增殖的抑制率，從531味藥物中篩選出對(duì)人食管癌細(xì)胞 TE-1、EC9706、EC109、三種細(xì)胞株增殖都有明顯抑制作用的藥物（穿山龍、重樓、皂角和土貝母）；對(duì)穿山龍、重樓、皂角和土貝母四味中藥醇提物分別用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、和水萃

3、取，得到氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、和水萃取部位；用MTT法分別檢測(cè)穿山龍、重樓、皂角和土貝母四味中藥氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、和水萃取部位對(duì)人食管癌細(xì)胞 TE-1、EC9706、EC109增殖的影響，篩選出抑制細(xì)胞作用最明顯的萃取部位，組成清熱化痰方，測(cè)定清熱化痰方及其拆方對(duì)人食管癌三種細(xì)胞作用的量效關(guān)系；倒置熒光顯微鏡觀察清熱化痰方及其拆方對(duì)人食管癌細(xì)胞 TE-1、EC9706、EC109形態(tài)的影響；運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定清熱化痰方及其拆方對(duì)

4、人食管癌細(xì)胞 TE-1、EC9706、EC109細(xì)胞周期的影響；運(yùn)用 Werstern-blot法檢測(cè)清熱化痰方及其拆方對(duì)人食管癌 TE-1、EC9706、EC109細(xì)胞EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ERK與 PLCε1—p53—NFkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1、從531味中藥中篩選出最佳抑制三種食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的穿山龍、重樓、皂角和土貝母四種中藥。
　　2、用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水分

5、部提取穿山龍、重樓、皂角和土貝母四種中藥，篩選出四種中藥最佳抑制三種食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的正丁醇有效部位。
　　3、用穿山龍、重樓、皂角和土貝母四種中藥正丁醇有效部位組成的清熱化痰方及拆方皆能明顯抑制人食管癌 TE-1、EC9706、 EC109三種細(xì)胞的增殖，且以清熱化痰方全方組作用最為明顯。
　　4、、清熱化痰方及其拆方對(duì)食管癌 TE-1、EC9706、 EC109三種細(xì)胞生長(zhǎng)皆有很強(qiáng)的抑制作用，其中全方作用最強(qiáng)，并隨藥物濃度

6、和藥物作用時(shí)間，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)依賴關(guān)系和時(shí)間—效應(yīng)依賴關(guān)系。
　　5、清熱化痰方及其拆方對(duì)TE-1、EC9706、 EC109細(xì)胞周期均有明顯影響，其中對(duì)TE-1細(xì)胞：與空白對(duì)照組比較，清熱組、化痰組和全方組G1期細(xì)胞百分比均有所下降，其中全方組下降最顯著； S期各治療組細(xì)胞百分比顯著增加，其中化痰組增加最為明顯，抑制強(qiáng)弱依次為化痰組>全方組>清熱組，G2期細(xì)胞百分比無(wú)明顯變化；對(duì)EC9706細(xì)胞：與空白對(duì)照組比較，

7、清熱組、化痰組和全方組G1期細(xì)胞百分比均無(wú)明顯變化；S期各治療組細(xì)胞百分比有所下降，其中全方組下降最為明顯，G2期各治療組細(xì)胞百分比明顯升高，其中全方組升高最明顯，抑制強(qiáng)弱依次為全方組>清熱組>化痰組；對(duì)EC109細(xì)胞：與空白對(duì)照組比較，清熱組、化痰組和全方組G1期細(xì)胞百分比均有所降低；S期各治療組細(xì)胞百分比顯著升高，其中全方組升高最為明顯,抑制強(qiáng)弱依次為全方組>清熱組>化痰組，G2期各治療組細(xì)胞百分無(wú)明顯變化。
　　6、人食管癌

8、 TE-1、EC9706、 EC109三種細(xì)胞皆可以檢測(cè)到 EGFR、PLC-γ1、PKC-α、ERK、PLCε1及 NFkB蛋白分子不同程度的過(guò)表達(dá)和p53蛋白分子的低表達(dá)。
　　7、當(dāng)用 IC50藥物劑量處理細(xì)胞時(shí)，清熱化痰方及其拆方各治療組均能下調(diào)食管癌 TE-1、EC9706、 EC109三種細(xì)胞 EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ER K信號(hào)通路各蛋白表達(dá)水平，同時(shí)可以下調(diào) PLCε1—p53—NFkB信號(hào)通路中PLC

9、ε1和NFkB各蛋白表達(dá)水平、提高p53蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論：
　　1、清熱化痰組、清熱組、化痰組均能明顯抑制人食管癌細(xì)胞 TE-1、EC9706、EC109的增殖，且均以清熱化痰全方組效果最好；清熱、化痰二法連用具有協(xié)同作用。
　　2、清熱化痰方作用于 TE-1細(xì)胞：清熱化痰方及其拆方對(duì) TE-1細(xì)胞周期有明顯影響，并且清熱化痰方及其拆方各治療組藥物主要將細(xì)胞阻滯于S期，從而抑制人食管癌 TE-1細(xì)胞的增殖;清熱

10、化痰方作用于 EC9706細(xì)胞：清熱化痰方及其拆方對(duì) EC9706細(xì)胞周期有明顯影響，并且清熱化痰方及其拆方各治療組藥物主要將細(xì)胞阻滯于 G2期，從而抑制人食管癌EC9706細(xì)胞的增殖；清熱化痰方作用于 EC109細(xì)胞：清熱化痰方及其拆方對(duì) EC109細(xì)胞周期有明顯影響，并且清熱化痰方及其拆方各治療組藥物主要將細(xì)胞阻滯于 S期，從而抑制人食管癌 EC109細(xì)胞的增殖。
　　3、食管癌發(fā)病與 EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ER

11、K與 PLCε1—p53—NFkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中EGFR、PLC-γ1、PKC-α、ERK、PLCε1及 NFkB的表達(dá)增強(qiáng)和p53的表達(dá)減弱密切相關(guān)。
　　4、清熱化痰方通過(guò)不同程度抑制 TE-1、EC9706、EC109細(xì)胞 EGFR—PLC-γ1—PKC-α—ERK與 PLCε1—p53—NFkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中EGFR、PLC-γ1、PKC-α、ERK、PLCε1及 NFkB蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)升高p53的表達(dá)量，從而發(fā)揮其