TRAF3和VPS33B在血小板激活和血栓形成中的作用及其機(jī)制.pdf

1、第一部分TRAF3和VPS33B血小板特異性基因敲除小鼠的繁殖和鑒定
　　目的：制備腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TNF receptor associated factor3, TRAF3）和空泡分選蛋白33同系物B（vacuolar protein sorting33 homolog B，VPS33B）血小板特異性基因敲除小鼠，用于研究TRAF3和VPS33B在血小板功能中的作用。
　　方法：通過(guò)實(shí)驗(yàn)室已有的VPS33Bf

2、l/fl基因打靶小鼠,TRAF3fl/fl基因打靶小鼠和Pf4 Cre小鼠，繁殖建立血小板的VPS33B和TRAF3特異性基因敲除小鼠和它的背景對(duì)照雜合子小鼠。并用PCR和western blotting方法檢測(cè)基因敲除小鼠的基因型和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：通過(guò)數(shù)代的繁殖，建立起穩(wěn)定可靠的TRAF3和VPS33B基因敲除模型，并在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，采取小鼠尾部 PCR基因鑒定的方法，來(lái)檢測(cè)基因敲除小鼠和其雜合子基因?qū)φ?，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

3、
　　結(jié)論：LoxP/Cre條件性基因敲除的方法，能克服基因敲除TRAF3和VPS33B引起的高的致死率，成功建立了研究TRAF3和VPS33B的條件性基因敲除小鼠模型。
　　第二部分TRAF3基因敲除對(duì)血小板聚集和血栓形成的影響及其機(jī)制
　　目的：CD40配體(CD40L)是腫瘤壞死因子 TNF家族的成員分子。CD40L結(jié)合到CD40上，增強(qiáng)血小板激活和血栓形成。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TNF receptor a

4、ssociated factor, TRAF）家族在CD40L-CD40相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要角色。目前，尚無(wú)報(bào)道研究 TRAF家族成員 TRAF3在血小板中的表達(dá)和功能。因此，本研究通過(guò) TRAF3特異性基因敲除小鼠研究 TRAF3在血小板聚集和血栓形成中的作用及其機(jī)制。
　　方法：采用血小板聚集儀觀察 TRAF3-/-和 wildtype小鼠對(duì)不同激動(dòng)劑（collagen，thrombin，Par4）誘導(dǎo)的血小板聚集的影響，并

5、檢測(cè)外源性添加CD40L對(duì) TRAF3-/-和 wildtype小鼠血小板聚集的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)和 western blotting檢測(cè)TRAF3-/-和wildtype小鼠血小板上GPⅥ和整合素β3表達(dá)的變化，以及TRAF3-/-和wildtype小鼠止血和血栓形成時(shí)間的變化。
　　結(jié)果：本研究發(fā)現(xiàn)，在人和小鼠的血小板細(xì)胞中都可檢測(cè)到TRAF3的表達(dá)。作為血小板聚集和激活的負(fù)性調(diào)控因子，TRAF3敲除顯著增加凝血酶和膠原誘導(dǎo)

6、的血小板聚集和釋放。血小板表面膠原受體GPⅥ、整合素αⅡbβ3和TRAF2的表達(dá)都沒(méi)有被敲除 TRAF3影響，說(shuō)明在 TRAF3敲除小鼠中增高的血小板激活并不是因?yàn)檠“迨荏w表達(dá)的增高，也不是由于 TRAF3基因敲除引起其它TRAF家族蛋白比如TRAF2蛋白表達(dá)的變化。在TRAF3敲除小鼠中，氯化鐵誘導(dǎo)的動(dòng)脈血栓模型中的血栓形成時(shí)間顯著降低，但在小鼠斷尾流血時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，止血時(shí)間未發(fā)現(xiàn)受TRAF3基因敲除的影響。
　　結(jié)論：TRAF

7、3在血小板激活和血栓形成中具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用。這一作用和TRAF家族其它的血小板功能蛋白不同，不依賴CD40L和CD40等血小板表面的受體實(shí)現(xiàn)。
　　第三部分 VPS33B基因敲除對(duì)血小板聚集和血栓形成的影響及其機(jī)制
　　目的：整合素是一種異質(zhì)二聚體膜蛋白，包含α和β亞基，在細(xì)胞粘附和轉(zhuǎn)移等各種生理功能中起著基礎(chǔ)性的重要作用，血小板整合素αIIbβ3在血小板功能和生理止血中可能有著重要的意義。調(diào)節(jié)血小板中整合素激活的分子機(jī)制目

8、前尚不清楚。VPS33B是一種新的整合素結(jié)合蛋白。目前，尚無(wú)報(bào)道研究VPS33B在血小板中的表達(dá)和功能。因此，本研究通過(guò)VPS33B特異性基因敲除小鼠研究VPS33B在血小板聚集和血栓形成中的作用及其機(jī)制。
　　方法：采用血小板聚集儀觀察 VPS33B敲除小鼠對(duì)不同激動(dòng)劑（collagen，thrombin）誘導(dǎo)的血小板聚集和釋放的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VPS33B敲除小鼠和野生對(duì)照型小鼠血小板血小板整合素αIIbβ3等指標(biāo)的含

9、量以及結(jié)合率。采用熒光顯微鏡觀察VPS33B敲除和過(guò)量表達(dá)VPS33B對(duì)血小板在固化纖維蛋白原上的擴(kuò)展等功能影響。觀察VPS33B敲除對(duì)斑塊回縮的影響。采用蛋白印跡法檢測(cè) VPS33B對(duì)血小板的主要信號(hào)通路蛋白及血小板“由外向內(nèi)”信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。
　　結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn) VPS33B作為 Sec1/Munc18（SM）蛋白家族的一員，能直接和整合素β亞基結(jié)合。在 CHO細(xì)胞株中過(guò)量表達(dá) VPS33B能增強(qiáng)αIIbβ3 outside-

10、in信號(hào)通路而不影響 inside-out信號(hào)通路。我們構(gòu)建了血小板特異性VPS33B敲除小鼠，從這些小鼠血液中分離的血小板具備正常的生理形態(tài)，然而它們?cè)诶w維蛋白原上的擴(kuò)展功能發(fā)生了改變，斑塊回縮功能也受到了影響。在VPS33B敲除小鼠中，在低濃度激動(dòng)劑的刺激下，血小板的聚集和ATP的釋放功能都減弱。在VPS33B敲除小鼠中小鼠斷尾流血時(shí)間和血栓形成時(shí)間對(duì)比野生型小鼠都延長(zhǎng)了。
　　結(jié)論：我們的研究表明 VPS33B是一種新的血小