β-內(nèi)啡肽及其受體在增生性瘢痕感覺異常發(fā)生中的分子機制及相關(guān)研究.pdf

1、背景:
　　 全世界每年約有1億多創(chuàng)傷患者發(fā)生病理性的瘢痕增生。過度增生的瘢痕屬于一種皮膚纖維的增生性疾病，多由燒傷、撕裂傷、摩擦傷、手術(shù)損傷、洞穿性損傷和預(yù)防接種等各類創(chuàng)傷造成創(chuàng)面的病理性愈合而產(chǎn)生，因為有真皮深層的損傷，這些患者往往伴有瘙癢、疼痛和攣縮等癥狀，其中尤以瘙癢與灼痛兩種感覺異常最為常見。既往研究表明，燒傷患者中87％的成人和100％的兒童都受到以上兩種癥狀的影響，其中有73.3％的患者表現(xiàn)為癢，67.6％的患者則

2、表現(xiàn)有明顯的為痛感。瘢痕增生早期，瘙癢越重，瘢痕增厚越快，如此形成惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響了增生性瘢痕患者的生活質(zhì)量。
　　 病理性愈合的瘢痕組織出現(xiàn)瘙癢與疼痛等感覺異常來源于細(xì)小類神經(jīng)纖維。而這些細(xì)小類纖維在表皮與真皮不正常的結(jié)構(gòu)狀態(tài)可能對修復(fù)細(xì)胞表面受體和細(xì)胞外配體產(chǎn)生影響。感覺神經(jīng)肽是架起神經(jīng)與非神經(jīng)系統(tǒng)之間聯(lián)系的橋梁，在維持著皮膚完整性和參與組織重建等多個環(huán)節(jié)起作用。但是，既往更多探討神經(jīng)肽中的P物（substanceP，SP

3、）、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitoningene-relatedprotein,CGRP）及其受體(Neurokininreceptor，NKR)對創(chuàng)面愈合的影響，也包括神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子及其受體的研究結(jié)果。雖然獲得一些進(jìn)展，但對病理性愈合狀態(tài)下感覺紊亂的探討幾乎是空白。
　　 近來人們發(fā)現(xiàn)，皮膚還表達(dá)另一類較為特殊的神經(jīng)肽即阿片肽，主要有β-內(nèi)啡肽(beta-endorphin)、腦啡肽(Enkephalin,Enk

4、)和強啡肽(Dynorphins，Dyn)等亞型。人皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生β-內(nèi)啡肽，同時該受體陽性的角質(zhì)形成細(xì)胞簇?fù)碓跓o髓神經(jīng)纖維終末端周圍。因此，阿片受體系統(tǒng)同樣參與神經(jīng)與皮膚之間的直接聯(lián)系，成為人們關(guān)注的對象。
　　 有研究顯示，除了已知的功能，mu型(μ-opioidreceptor,MOR)、delta型(δ-opioidreceptor，DOR)和kappa型(κ-opioidreceptor，KOR)三種阿片受體具

5、有調(diào)節(jié)非神經(jīng)元細(xì)胞的功能，包括它們的免疫活性和各種生理功能。角質(zhì)形成細(xì)胞主要表達(dá)MOR。而皮膚真皮層的成纖維細(xì)胞膜表面表達(dá)的阿片肽受體與角質(zhì)形成細(xì)胞不同，其主要為DOR和KOR。這似乎與皮膚的痛癢“分層假說”相契合。
　　 程飚等人將病理性瘢痕與正常皮膚對照，采用免疫熒光染色及PT-PCR證實:β-內(nèi)啡肽和MOR在角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均表達(dá)，在正常皮膚中表皮內(nèi)僅有少量的β-內(nèi)啡肽，角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)的阿片受體也較少，可能參與傳

6、遞皮膚的“癢”和“痛”感覺。損傷后，再上皮化的表皮細(xì)胞和激活狀態(tài)的成纖維細(xì)胞表型發(fā)生改變，同時可能受神經(jīng)纖維與末梢的影響，β-內(nèi)啡肽分泌和分布異常，而有限的阿片受體難以將他們完全結(jié)合。當(dāng)創(chuàng)傷愈合形成瘢痕組織時，特別是在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織表皮和真皮層中出現(xiàn)，“剩余”的阿片肽分泌增多或其受體表達(dá)上調(diào)，二者發(fā)生不匹配。阿片受體各亞型在人正常皮膚與增生性瘢痕組織中的表達(dá)具有不同的分布特征，它們可能是在造成瘢痕愈合后感覺異常的重要因素。同時

7、，三種亞型阿片受體的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常皮膚組織。初步證實了內(nèi)源性阿片肽及其受體病理性瘢痕感覺異常有關(guān)。我們推測阿片系統(tǒng)在皮膚中以自分泌和旁分泌的形式影響表皮與真皮的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的改變，在多種阿片肽及其各自受體的時空表達(dá)上發(fā)生異常，從而釋放出各類細(xì)胞因子（如白介素等）和組織胺等介質(zhì)，于是出現(xiàn)感覺異常。目前，內(nèi)源性阿片肽及其多種阿片類受體亞型的研究多集中在皮膚急慢性、過敏性炎癥疾病中，有關(guān)內(nèi)啡肽-阿片類受體在組

8、織愈合后，病理性瘢痕中的表達(dá)特點及變化規(guī)律尚未見報道。闡明各類型阿片肽在真表皮中的表達(dá)特點，不同阿片受體亞型的作用規(guī)律及彼此的相互關(guān)系，可能是揭示病理性瘢痕感覺紊亂機制的關(guān)鍵。
　　 目的:
　　 1、選擇內(nèi)源性阿片肽（β-內(nèi)啡肽、腦啡肽和強啡肽）及其它們各類受體亞型(μ-opioidreceptor,δ-Opioidreceptor，κ-Opioidreceptor)為主要觀察對象，進(jìn)一步確立阿片肽與病理性創(chuàng)面愈合結(jié)局

9、的關(guān)系;
　　 2、選擇有痛癢的增生性瘢痕患者，觀察內(nèi)源性阿片肽及其受體亞型在體即時表達(dá)的規(guī)律及差別以及各類阿片肽受體拮抗劑對感覺變化的影響作用。為病理性瘢痕患者感覺異常的發(fā)生機制及治療開拓新思路。
　　 方法:
　　 1、β-內(nèi)啡肽、腦啡肽、強啡肽含量在大鼠單純皮膚瘙癢模型中動態(tài)變化的測定。取成年SD大鼠，皮下注射右旋糖酐溶液(60mg:1ml)0.2ml，成功建立皮膚瘙癢模型;大鼠麻醉后，腹部皮膚備皮，微滲析

10、探針穿過皮下，以生理鹽水作為滲析液，分別收集大鼠在正常生理狀態(tài)下、注射右旋糖酐后、同時注射納曲酮和右旋糖酐后三種狀態(tài)下的滲析液樣品，收集每種狀態(tài)下3個小時內(nèi)共10個樣品。用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linkedimmunosorbentessay，ELISA)法測定每個樣品中β-內(nèi)啡肽、腦啡肽、強啡肽的含量，觀察其在不同狀態(tài)下三種阿片肽含量的動態(tài)變化。
　　 2、瘢痕組織中β-內(nèi)啡肽、腦啡肽、強啡肽及其相應(yīng)受體的表達(dá)與含量測定

11、。將2010年4月-2011年9月間獲取的感覺異常明顯的42例增生性瘢痕組織(分為三組:A組:沒有痛癢組(n=20)，B組:單純癢組(n=14)和C組(n=8):有痛癢組）與5例正常皮膚組織（既無痛且無癢，D組），采用免疫熒光染色觀察β-內(nèi)啡肽表達(dá)定位情況;同時，將標(biāo)本制成勻漿用ELISA法檢測勻漿中β-內(nèi)啡肽、腦啡肽、強啡肽的含量。另將9例痛或癢癥狀明顯的增生性瘢痕患者分為四組（有痛和癢、單純癢、單純痛和沒有痛癢），實時熒光定量技術(shù)(

12、Real-timequantitativepolymerasechainreaction,PT-PCR)分別檢測各組瘢痕組織中MOR、KOR和DOR的mRNA表達(dá)水平。
　　 3、微滲析針檢測在體情況下阿片肽在皮膚中的含量變化規(guī)律及阿片肽拮抗劑的應(yīng)用。征集4名增生性瘢痕患者，病變部位組織色紅、質(zhì)硬、突出皮面，且痛癢癥狀明顯。選取每名患者“痛癢”最為明顯的瘢痕局部，常規(guī)消毒。瘢痕下4-7mm穿刺入微滲析探針，長約4cm，注射器抽取

13、生理鹽水2.5ml，排氣后置入微滲析泵，將探針與注射器連接，探針尾部接集液管。收集10小時內(nèi)共3個樣品。以每名患者自身正常皮膚作為對照，重復(fù)上述操作。將收集的所有樣品用ELISA法測定每個樣品中β-內(nèi)啡肽、腦啡肽、強啡肽的含量。指導(dǎo)患者在瘙癢明顯的增生性瘢痕局部涂抹0.02％納曲酮TAT凝膠，2/日，持續(xù)一周。用藥前后分別用痛癢線性模擬標(biāo)尺(visualanaloguescale)測定每個患者的“痛癢”指數(shù)及觀察瘢痕局部的變化。

14、　　 4、統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，多樣本比較采用單因素方差方析，兩兩比較采用LSD法檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、向大鼠注射右旋糖酐即成功建立大鼠皮膚瘙癢模型后，皮膚中各類阿片肽均發(fā)生改變但較穩(wěn)定的是β-內(nèi)啡肽，其含量明顯升高的，且高于正常生理狀態(tài)下的含量。同時注射右旋糖酐和阿片肽拮抗劑納曲酮后發(fā)現(xiàn)β-內(nèi)啡肽有下降的趨勢。
　　 2、人正常皮膚組織和

15、瘢痕組織中均可見β-內(nèi)啡肽表達(dá)，在真皮層的周圍神經(jīng)末梢、成纖維細(xì)胞和單核樣細(xì)胞等處。同時在表皮部分角質(zhì)形成細(xì)胞呈陽性，且主要表達(dá)在細(xì)胞膜上，并且單純癢組和痛癢組β-內(nèi)啡肽表達(dá)明顯強于無痛癢組。
　　 3、三種阿片肽在正常皮膚與增生性瘢痕組織中均有表達(dá)。各組β-內(nèi)啡肽含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=24.604，P＜0.001)，且各增生性瘢痕組織中的β-內(nèi)啡肽含量均顯著高于正常皮膚組。B組β-內(nèi)啡肽含量顯著高于A組(P=0.001

16、)和C組(P=0.008);A組與C組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.881)。各組Enk含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.918，P=0.045)，其中A組(P=0.011)、B組(P=0.008)Enk含量顯著高于正常皮膚組，其余各組間Enk含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組Dyn含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.729，P=0.018)，各增生性瘢痕組Dyn含量均顯著高于正常皮膚組，其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

17、
　　 4、MOR、KOR和DOR在增生性瘢痕組織中均有表達(dá)。在MOR的mRNA表達(dá)水平中，痛癢組瘢痕組織中mRNA含量高于其余各組;在KOR的mRNA表達(dá)水平中，單純痛與痛癢組瘢痕組織中mRNA含量高于其余兩組;在DOR的mRNA表達(dá)水平中，單純痛與痛癢組瘢痕組織中mRNA含量高于其余各組。
　　 5、在體情況下增生性瘢痕組織液中β-內(nèi)啡肽(t=-4.017，P=0.001)、Enk(t=-5.495，P＜0.001)

18、含量較正常皮膚明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;增生性瘢痕組織液與正常皮膚組織液中強啡肽含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.100，P=0.271)。患者局部使用選擇性阿片肽拮抗劑——納曲酮后痛癢指數(shù)較用藥前降低。
　　 結(jié)論:
　　 1、皮膚瘙癢的發(fā)生與阿片肽及其受體相關(guān)。
　　 2、三種阿片肽β-內(nèi)啡肽、強啡肽、腦啡肽及其相應(yīng)受體亞型MOR、KOR和DOR均參與增生性瘢痕患者的感覺異常的發(fā)生，其中β-內(nèi)啡肽及MOR與