淺藍(lán)菌素聯(lián)合吉西他濱抑制人胰腺癌細(xì)胞株BXPC-3生長(zhǎng)及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分，淺藍(lán)菌素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株BXPC-3的影響及機(jī)制
　　 目的：研究脂肪酸合酶（fattyacidsynthane，F(xiàn)AS）抑制劑淺藍(lán)菌素(Cerulenin，Cer)對(duì)胰腺癌BXPC-3細(xì)胞體外生長(zhǎng)和凋亡的影響，并初步探討可能的作用機(jī)制。
　　 方法：采用不同濃度(O、2.5、5、10、20、40μg/ml)Cer處理胰腺癌細(xì)胞BXPC-3，細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)法(CCK8)檢測(cè)OD值，計(jì)算對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組BXP

2、C-3細(xì)胞的抑制率，并計(jì)算最適宜的CerIC50；取Cer濃度為O、5、10、20μg/ml處理胰腺癌BXPC-3細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)及AnnexinV/PI早期凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction,RT-PCR)檢測(cè)FASmRNA、Bcl-2mRNA、BaxmRNA、Caspase8mRNA、Caspase9mRNA、Caspas

3、e3mRNA表達(dá)水平的變化；免疫印跡法(WesternBlot)檢測(cè)細(xì)胞凋亡因子Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)情況，酶測(cè)定法檢測(cè)Caspase8、Caspase9、Caspase3活性。
　　 結(jié)果：(1)CCK8法顯示Cer可明顯抑制BXPC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)，并隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。(2)流式細(xì)胞術(shù)及AnnexinV\PI早期凋亡檢測(cè)出BXPC-3細(xì)胞經(jīng)Cer作用48小時(shí)后，細(xì)胞周期S期比例上升，

4、從（5.18±0.25）％上升到（25.15±1.15）%，G2期細(xì)胞比例下降(P＜0.05)。細(xì)胞有明顯凋亡，且以早期凋亡為主，在5μg/ml濃度下早期凋亡率為（11.67±0.65）%，l0μg/ml濃度下為（29.1±1.31）%，而在20μg/ml濃度下為（48.8±1.23）%，與Cer濃度呈正相關(guān)。(3)RT-PCR檢測(cè)FASmRNA、Bcl-2mRNA、BaxmRNA、Caspase8mRNA、Caspase9mRNA、C

5、aspase3mRNA表明BXPC-3細(xì)胞經(jīng)Cer作用48小時(shí)后，F(xiàn)ASmRNA、Bcl-2mRNA的表達(dá)呈濃度依賴性下降，BaxmRNA、Caspase8mRNA、Caspase9mRNA、Caspase3mRNA呈濃度依賴性上升，各濃度組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(4)WesternBlot結(jié)果顯示Cer作用于BXPC-3細(xì)胞48h可使細(xì)胞中的Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax蛋白表達(dá)升高，在Cer0μg/ml、5μ

6、g/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度下Bcl-2/Bax比值分別為（4.29±0.15）、（1.82±0.02）、（1.01±0.08）、（0.38±0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(5)酶測(cè)定法檢測(cè)Cer作用于BXPC-3細(xì)胞48h可使Caspase8、Caspase9、Caspase3的活性增加，且呈濃度依賴性(P＜0.05)。Cer5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml濃度組Caspase3活性分別為

7、對(duì)照組的（1.75±0.31）、（3.27±0.01）、（4.96±0.02）倍；Caspase9活性分別為對(duì)照組的（1.40±0.4）、（2.12±0.06）、（3.39±0.02）倍；Caspase8活性分別為對(duì)照組的（1.26±0.07）、（1.86±0.11）、（2.5±0.02）倍。
　　 結(jié)論：Cer以時(shí)間、濃度依賴方式抑制胰腺癌BXPC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖；阻滯細(xì)胞周期于S期；主要通過(guò)線

8、粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。
　　 第二部分，淺藍(lán)菌素聯(lián)合吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞BXPC-3的影響
　　 目的：探討Cer聯(lián)合吉西他濱(Gemcitabine，GEM)對(duì)胰腺癌細(xì)胞BXPC-3的協(xié)同抑制作用及機(jī)制。
　　 方法：以濃度為10μg/ml的Cer聯(lián)合20μmol/L的GEM處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞，應(yīng)用CCK8法檢測(cè)OD值，計(jì)算對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組BXPC-3細(xì)胞的抑制率；AnnexinV

9、/PI雙染法檢測(cè)BXPC-3細(xì)胞早期凋亡情況；RT-PCR半定量檢測(cè)Bcl-2mRNA、BaxmRNA表達(dá)水平的變化，WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞凋亡因子蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：Cer和GEM都能有效地抑制人胰腺癌BXPC-3細(xì)胞增殖，二者聯(lián)合作用后，具有協(xié)同效應(yīng)；Cer組作用BXPC-3細(xì)胞48h時(shí)細(xì)胞早期凋亡為（31.37±1.04）%，GEM組為（38.33±0.75）%，聯(lián)合組為（69.43±0.