吉西他濱對胰腺癌細胞的免疫調節(jié)作用及其機制研究.pdf

1、【目的】：
　　1、研究吉西他濱在胰腺癌治療中的免疫調節(jié)作用及其具體分子機制。
　　2、研究ULBP2在胰腺癌患者血清中的表達，探討ULBP2的表達與患者臨床病理參數、預后間的相關性，探討血清ULBP2水平對胰腺癌的診斷價值。
　　【方法】：
　　1、ELISA檢測胰腺癌化療藥物吉西他濱作用下的胰腺癌細胞株分泌可溶型ULBP2蛋白的水平，以及流式細胞術檢測胰腺癌細胞株表達膜型ULBP2蛋白的水平；
　　2、

2、建立胰腺癌細胞與NK細胞共培養(yǎng)殺傷體系后，通過CCK8法檢測吉西他濱對胰腺癌免疫殺傷敏感性的影響；
　　3、通過定量PCR技術、western blot檢測吉西他濱對胰腺癌細胞中ADAM10基因和蛋白表達的影響；進一步通過設計合成ADAM10 siRNA并轉染胰腺癌細胞，在驗證ADAM10表達水平下調后，通過CCK8法檢測ADAM10siRNA對胰腺癌細胞增殖的影響，以及通過ELISA檢測ADAM10siRNA對胰腺癌細胞表達可溶

3、型ULBP2蛋白的影響；
　　4、通過免疫組織化學染色法檢測胰腺癌組織標本中ADAM10的表達水平，以及通過ELISA檢測胰腺癌患者血清中sULBP2的表達水平，通過統(tǒng)計學分析，評估在胰腺癌血清中sULBP2的表達與患者臨床資料和術后預后的關系、及其與組織中ADAM10表達水平間的相關性；
　　5、收集吉西他濱處理后的胰腺癌細胞PANC-1和未經處理的對照組細胞，通過全轉錄組測序，分析處理前后胰腺癌細胞中環(huán)狀RNA、lncR

4、NA和mRNA的差異表達。進一步通過生物學分析，將差異基因按其功能及通路進行分類，以便進一步尋找差異基因中可能參與免疫調控的基因及通路蛋白。
　　【結果】：
　　1、通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液，發(fā)現吉西他濱能夠抑制胰腺癌細胞PANC-1和MIA PACA-2細胞分泌可溶型ULBP2；而流式細胞術的檢測結果表明，吉西他濱可提高胰腺癌細胞PANC-1和MIA PACA2表面ULBP2膜型蛋白的表達。
　　2、通過建立

5、人NK細胞系與人胰腺癌細胞系的共培養(yǎng)體系，并用CCK-8細胞毒性實驗觀察吉西他濱對 NK細胞殺傷胰腺癌細胞效率的影響。實驗結果發(fā)現，在抑制培養(yǎng)上清中可溶型sULBP2的分泌表達后，吉西他濱組NK細胞的殺傷效明顯高于DMSO對照組，在培養(yǎng)體系中加入重組的可溶型sULBP2蛋白能逆轉NK92細胞的殺傷活性。
　　3、實時定量PCR和western blot結果表明，吉西他濱能下調胰腺癌細胞株PANC-1和MIA PACA-2中ADAM

6、10表達水平。ADAM10 siRNA轉染胰腺癌細胞PANC-1和MIA PACA-2，有效地沉默PANC-1和MIA PACA-2中ADAM10蛋白表達水平后，同樣有效地下調了PANC-1和MIA PACA-2細胞培養(yǎng)上清中分泌可溶型ULBP2的水平。
　　4、ELISA檢測胰腺癌患者血清中 ULBP2的表達水平，發(fā)現胰腺癌患者的血清中sULBP2濃度顯著高于正常健康對照人群，同時胰腺癌患者腫瘤組織的免疫組化結果顯示ADAM10

7、主要分布在腫瘤細胞的胞漿內，不同患者的ADAM10染色程度不同。結合患者的臨床和病理參數，統(tǒng)計發(fā)現，血清sULBP2濃度與組織中ADAM10表達呈正相關。血清sULBP2濃度與CA199（p=0.013），淋巴結轉移(p=0.009)以及患者總生存期(p=0.045)密切相關。
　　5、全轉錄組測序分析處理前后胰腺癌細胞中環(huán)狀RNA、lncRNA和mRNA的差異表達，發(fā)現72個環(huán)狀RNA上調，56個環(huán)狀RNA下調；以及1025個m

8、RNA表達上調，656個mRNA表達下調。通過生物學分析，將差異基因按其功能及通路進行分類，并通過流行的miRNA靶基因預測軟件進行差異環(huán)狀RNA-miRNA相互作用預測，以推斷可以作為”miRNA海綿“的環(huán)狀RNA。
　　【結論】：
　　1、吉西他濱抑制胰腺癌細胞ULBP2的蛋白胞外脫落，通過ULBP2可溶型蛋白與膜蛋白競爭結合NK細胞活化受體NKG2D，從而促進NK細胞殺傷胰腺癌細胞。
　　2、吉西他濱下調胰腺癌表

9、達ADAM10蛋白酶，從而抑制其對ULBP2蛋白的蛋白切割。ADAM10 siRNA在轉染下調胰腺癌細胞中ADAM10蛋白表達后，能夠下調胰腺癌細胞培養(yǎng)上清中分泌可溶型ULBP2蛋白。
　　3、胰腺癌患者血清中可溶型ULBP2的表達水平明顯高于正常健康志愿者，且與胰腺癌淋巴結轉移和患者總生存其有關。血清中ULBP2表達水平與患者腫瘤組織中ADAM10表達呈正相關。
　　4、通過全轉錄組測序，分析了吉西他濱處理前后胰腺癌細胞中