B7-H3基因沉默聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)atu8988t生長(zhǎng)影響及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分:人B7-H3分子siRNA的設(shè)計(jì)及siRNA轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
　　目的：設(shè)計(jì)并化學(xué)合成人B7-H3基因的小分子干擾RNA，并進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)染人胰腺癌Patu8988t細(xì)胞的條件。
　　方法：遵循RNA干擾目標(biāo)序列的選取原則，利用互聯(lián)網(wǎng)資源對(duì)人B7-H3基因mRNA序列設(shè)計(jì)4條小干擾RNA（siRNA）。以陰性熒光素特異性siRNA為報(bào)告基因，通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染人胰腺癌Patu8988t細(xì)胞，

2、利用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)觀察轉(zhuǎn)染效率，CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)人胰腺癌Patu8988t細(xì)胞的毒性。
　　結(jié)果：成功設(shè)計(jì)并合成4對(duì)人B7-H3基因的小分子干擾RNA，在96孔板中篩選出最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件為0.125μL Lipofectamine2000和5pmol siRNA。
　　結(jié)論：成功設(shè)計(jì)并合成了人B7-H3基因的小分子干擾RNA，同時(shí)優(yōu)化的最佳轉(zhuǎn)染條件為進(jìn)一步研究人B7-H3小干擾RNA功能提供了條件。
　　第二部

3、分:B7-H3小干擾RNA對(duì)人胰腺癌Patu8988t細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　目的：研究B7-H3 siRNA對(duì)B7-H3高表達(dá)的人胰腺癌Patu8988t細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：從化學(xué)合成的4對(duì)小干擾RNA中篩選出最佳的靶向B7-H3 siRNA轉(zhuǎn)染人胰腺癌Patu8988t細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Western印跡分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)B7-H3表達(dá)，CCK-8檢測(cè)B7-H3表達(dá)被抑制后細(xì)胞

4、增殖的情況。
　　結(jié)果：B7-H3 siRNA能在 mRNA和蛋白水平下調(diào)人胰腺癌 Patu8988t細(xì)胞中B7-H3基因的表達(dá)（P<0.01）。B7-H3表達(dá)被抑制后，細(xì)胞生長(zhǎng)未受到明顯抑制（P＞0.05）。
　　結(jié)論：沉默B7-H3基因?qū)σ认侔㏄atu8988t細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯抑制作用。
　　第三部分 B7-H3 siRNA干擾聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌Patu8988t細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　目的：研究B7-H3 s

5、iRNA干擾聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌細(xì)胞Patu8988t生長(zhǎng)的影響方法：選擇適合的GEM的干預(yù)濃度為10μmol/L。設(shè)立空白對(duì)照組（B）：未干預(yù)空白細(xì)胞。GEM干預(yù)對(duì)照組（B+）：?jiǎn)渭僄EM干預(yù)；聯(lián)合干預(yù)對(duì)照組（NC+）：陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合GEM干預(yù)；聯(lián)合干預(yù)實(shí)驗(yàn)組（4+）：B7-H3siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合GEM干預(yù)。通過CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況。應(yīng)用Annexin-V/PI雙染色法，檢測(cè)各組細(xì)胞早期凋亡情況。運(yùn)用RT-P

6、CR檢測(cè)各組Caspase-3 mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-9 mRNA、Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表達(dá)。并且應(yīng)用Caspase活性試劑盒檢測(cè)各組的Caspase-3, Caspase-8 and Caspase-9酶活性。
　　結(jié)果：聯(lián)合干預(yù)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較其他對(duì)照組增殖明顯減低（p＜0.01）,其早期凋亡比例為(25.83±0.95)%較GEM干預(yù)對(duì)照組(18.6±0.76)%和聯(lián)合干預(yù)對(duì)

7、照組(20.30±1.08)%明顯增高(P<0.01)。聯(lián)合干預(yù)實(shí)驗(yàn)組的Caspase-3 mRNA, Caspase-8 mRNA, Caspase-9 mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)(P<0.05)，其Caspase-3, Caspase-8 and Caspase-9酶活性也較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；而其Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達(dá)水平較對(duì)聯(lián)合干預(yù)對(duì)照組無明顯變化。
　　結(jié)論：B7-H3沉默可提高Pat