人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜初步篩選及研究.pdf

1、目的：利用高通量長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs，LncRNAs)芯片檢測(cè)胰腺癌親本細(xì)胞株SW1990及吉西他濱耐藥株SW1990/GZ的lncRNA與mRNA表達(dá)譜變化，初步探索吉西他濱對(duì)SW1990細(xì)胞中l(wèi)ncRNA表達(dá)量的影響，并對(duì)差異表達(dá)的mRNA作進(jìn)一步的生物學(xué)信息分析，從新的角度探索胰腺癌耐藥發(fā)生的分子機(jī)制，從而為逆轉(zhuǎn)胰腺癌癌細(xì)胞耐藥治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：采用體外間歇濃度梯度遞增法構(gòu)建人

2、胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株SWl990/GZ；光學(xué)顯微鏡下觀察兩細(xì)胞形態(tài)；MTT法檢測(cè)SWl990/GZ相對(duì)于其親本細(xì)胞SW1990的耐藥性和耐藥倍數(shù)、繪制生長(zhǎng)曲線、計(jì)算倍增時(shí)間以及流式細(xì)胞儀分析 SW1990及 SWl990/GZ的細(xì)胞周期；運(yùn)用高通量 lncRNA芯片(Human LncRNA Microarray V2.0)比較胰腺癌耐藥細(xì)胞株 SWl990/GZ與親本細(xì)胞 SW1990之間lncRNA和mRNA表達(dá)譜差異；對(duì)差異表

3、達(dá)的mRNA行生物學(xué)信息分析；采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR對(duì)差異表達(dá)譜中的6個(gè) lncRNA（RP11-58D2.1，lincRNA-ZNF532，AP000221.1，CTC-338M12.5，CR619813，DDX6P）和9個(gè)mRNA（SYT1，F(xiàn)AM171B，ZNF331，F(xiàn)AM187B，CYP1A1，SRXN1，HIST1H2BL，TOMM40L，SPP1）進(jìn)行驗(yàn)證；將SW1990培養(yǎng)在含有吉西他濱濃度為1.5μM不同的時(shí)間（0,

4、1,2,4,8,16 d）及將SW1990培養(yǎng)在不同濃度（0,1,2,4,8,16μM）吉西他濱培養(yǎng)基中24h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SW1990細(xì)胞株lincRNA-ZNF532、DDX6P的表達(dá)量的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立了人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株SWl990/GZ，SWl990/GZ與SW1990同源。
　　2、在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上，SWl990/GZ較 SWl990發(fā)生了明顯改變；SW1990和

5、SWl990/GZ對(duì)吉西他濱的IC50值分別為3.03±0.27μmol/L、230.46±0.31μmol/L,耐藥指數(shù)（RI）達(dá)到71.6，兩者比較有顯著差異（P﹤0.01）。CCK-8法測(cè)得SW1990/GZ比SW1990細(xì)胞的生長(zhǎng)速度變慢，兩者的倍增時(shí)間分別為32.80±2.12h和22.36±1.78h（P﹤0.05）。與 SW1990細(xì)胞相比，SW1990/GZ的G1細(xì)胞增多（P﹤0.05），G2期細(xì)胞減少（P﹤0.05），

6、S期細(xì)胞比例無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　3、lncRNA芯片結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞株SW1990/GZ與親本細(xì)胞株的lncRNA和mRNA表達(dá)差異顯著：lncRNA中，2倍以上表達(dá)上調(diào)的lncRNA為1993條，2倍以上表達(dá)下調(diào)的lncRNA為2990條；mRNA中，2倍以上表達(dá)上調(diào)的mRNA為2671條，2倍以上表達(dá)下調(diào)的mRNA2088條，GO分析這些mRNA主要新陳代謝過(guò)程、細(xì)胞周期、分子粘合物、核苷酸結(jié)合物、激酶活性、細(xì)胞

7、核、細(xì)胞質(zhì)等方面有關(guān)聯(lián)，Pathway分析發(fā)現(xiàn)參與Toll-樣受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑、小細(xì)胞肺癌、慢性粒細(xì)胞白血病、胰腺癌、DNA復(fù)制、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、P53通路、糖酵解/糖異生等調(diào)節(jié)通路。
　　4、實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：與胰腺癌親本SW1990細(xì)胞相比，吉西他濱耐藥株SW1990/GZ中的lncRNA基因：RP11-58D2.1（p<0.01），lincRNA-ZNF532（p<0.01），AP000221.1（p<0.01）

8、表達(dá)上調(diào)，而lncRNA基因：CTC-338M12.5（p<0.05），CR619813（p<0.05），DD-X6P（p<0.01）表達(dá)下調(diào)；與胰腺癌親本SW1990細(xì)胞相比，吉西他濱耐藥株SW1990/GZ中的mRNA基因：SYT1，F(xiàn)AM171B，ZNF331，F(xiàn)AM187B，CYP1A1表達(dá)上調(diào)（p<0.01），而mRNA基因：SRXN1，HIST1H2BL，TOMM40L，SPP1表達(dá)下調(diào)（p<0.01），qRT-PCR檢測(cè)結(jié)

9、果與芯片結(jié)果是一致的。胰腺癌SW1990細(xì)胞中l(wèi)ncRNA（lincRNA-ZNF532、DDX6P）表達(dá)量受吉西他濱培養(yǎng)濃度及培養(yǎng)時(shí)間的影響。
　　結(jié)論：
　　1、成功的建立了人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株 SW1990/GZ，相對(duì)于親本細(xì)胞SW1990，其生物學(xué)特征發(fā)生了顯著改變；
　　2、lncRNA基因芯片是篩選胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株差異表達(dá)基因的一種理想有效的工具；
　　3、首次采用用 lncRNA基因芯