人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株中l(wèi)ncRNA表達譜初步篩選及研究.pdf

1、目的：利用高通量長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs，LncRNAs)芯片檢測胰腺癌親本細胞株SW1990及吉西他濱耐藥株SW1990/GZ的lncRNA與mRNA表達譜變化，初步探索吉西他濱對SW1990細胞中l(wèi)ncRNA表達量的影響，并對差異表達的mRNA作進一步的生物學信息分析，從新的角度探索胰腺癌耐藥發(fā)生的分子機制，從而為逆轉(zhuǎn)胰腺癌癌細胞耐藥治療提供新的靶點。
　　方法：采用體外間歇濃度梯度遞增法構(gòu)建人

2、胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株SWl990/GZ；光學顯微鏡下觀察兩細胞形態(tài)；MTT法檢測SWl990/GZ相對于其親本細胞SW1990的耐藥性和耐藥倍數(shù)、繪制生長曲線、計算倍增時間以及流式細胞儀分析 SW1990及 SWl990/GZ的細胞周期；運用高通量 lncRNA芯片(Human LncRNA Microarray V2.0)比較胰腺癌耐藥細胞株 SWl990/GZ與親本細胞 SW1990之間lncRNA和mRNA表達譜差異；對差異表

3、達的mRNA行生物學信息分析；采用實時熒光定量 PCR對差異表達譜中的6個 lncRNA（RP11-58D2.1，lincRNA-ZNF532，AP000221.1，CTC-338M12.5，CR619813，DDX6P）和9個mRNA（SYT1，F(xiàn)AM171B，ZNF331，F(xiàn)AM187B，CYP1A1，SRXN1，HIST1H2BL，TOMM40L，SPP1）進行驗證；將SW1990培養(yǎng)在含有吉西他濱濃度為1.5μM不同的時間（0,

4、1,2,4,8,16 d）及將SW1990培養(yǎng)在不同濃度（0,1,2,4,8,16μM）吉西他濱培養(yǎng)基中24h，采用實時熒光定量PCR檢測SW1990細胞株lincRNA-ZNF532、DDX6P的表達量的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立了人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株SWl990/GZ，SWl990/GZ與SW1990同源。
　　2、在細胞形態(tài)學上，SWl990/GZ較 SWl990發(fā)生了明顯改變；SW1990和

5、SWl990/GZ對吉西他濱的IC50值分別為3.03±0.27μmol/L、230.46±0.31μmol/L,耐藥指數(shù)（RI）達到71.6，兩者比較有顯著差異（P﹤0.01）。CCK-8法測得SW1990/GZ比SW1990細胞的生長速度變慢，兩者的倍增時間分別為32.80±2.12h和22.36±1.78h（P﹤0.05）。與 SW1990細胞相比，SW1990/GZ的G1細胞增多（P﹤0.05），G2期細胞減少（P﹤0.05），

6、S期細胞比例無明顯差異（P＞0.05）。
　　3、lncRNA芯片結(jié)果顯示耐藥細胞株SW1990/GZ與親本細胞株的lncRNA和mRNA表達差異顯著：lncRNA中，2倍以上表達上調(diào)的lncRNA為1993條，2倍以上表達下調(diào)的lncRNA為2990條；mRNA中，2倍以上表達上調(diào)的mRNA為2671條，2倍以上表達下調(diào)的mRNA2088條，GO分析這些mRNA主要新陳代謝過程、細胞周期、分子粘合物、核苷酸結(jié)合物、激酶活性、細胞

7、核、細胞質(zhì)等方面有關(guān)聯(lián)，Pathway分析發(fā)現(xiàn)參與Toll-樣受體信號傳導途徑、小細胞肺癌、慢性粒細胞白血病、胰腺癌、DNA復制、膀胱癌、非小細胞肺癌、P53通路、糖酵解/糖異生等調(diào)節(jié)通路。
　　4、實時定量PCR結(jié)果顯示：與胰腺癌親本SW1990細胞相比，吉西他濱耐藥株SW1990/GZ中的lncRNA基因：RP11-58D2.1（p<0.01），lincRNA-ZNF532（p<0.01），AP000221.1（p<0.01）

8、表達上調(diào)，而lncRNA基因：CTC-338M12.5（p<0.05），CR619813（p<0.05），DD-X6P（p<0.01）表達下調(diào)；與胰腺癌親本SW1990細胞相比，吉西他濱耐藥株SW1990/GZ中的mRNA基因：SYT1，F(xiàn)AM171B，ZNF331，F(xiàn)AM187B，CYP1A1表達上調(diào)（p<0.01），而mRNA基因：SRXN1，HIST1H2BL，TOMM40L，SPP1表達下調(diào)（p<0.01），qRT-PCR檢測結(jié)

9、果與芯片結(jié)果是一致的。胰腺癌SW1990細胞中l(wèi)ncRNA（lincRNA-ZNF532、DDX6P）表達量受吉西他濱培養(yǎng)濃度及培養(yǎng)時間的影響。
　　結(jié)論：
　　1、成功的建立了人胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株 SW1990/GZ，相對于親本細胞SW1990，其生物學特征發(fā)生了顯著改變；
　　2、lncRNA基因芯片是篩選胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株差異表達基因的一種理想有效的工具；
　　3、首次采用用 lncRNA基因芯