雞弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白截短基因sGRA8的克隆表達(dá)及ELISA診斷方法的建立.pdf

1、弓形蟲(chóng)病(Toxoplasmosis)是一種由剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）引起的世界性分布人畜共患寄生蟲(chóng)病，人和動(dòng)物的感染率都很高，嚴(yán)重危害人類健康，對(duì)孕婦和免疫缺陷、免疫抑制患者的損害尤甚，并給世界各國(guó)的畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)散養(yǎng)雞群中的弓形蟲(chóng)病感染不容忽視，平均在30％左右。人類通過(guò)接觸病雞或食用未煮熟的雞可感染弓形蟲(chóng)，因此加強(qiáng)對(duì)雞弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)，對(duì)防控弓形蟲(chóng)病及人類健康有著重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

2、>　　目前，對(duì)畜禽弓形蟲(chóng)感染的檢測(cè)手段主要有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和核酸檢測(cè)技術(shù)三類。ELISA法具有靈敏性高、特異性高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，且對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求不高，是一種優(yōu)良的檢測(cè)手段。市場(chǎng)上銷售的檢測(cè)雞弓形蟲(chóng)抗體的ELISA試劑盒特異性差、抗體檢出時(shí)間短，對(duì)感染后期的抗體無(wú)法檢出。近些年在國(guó)內(nèi)外，關(guān)于豬、牛、羊等家畜動(dòng)物弓形蟲(chóng)感染及抗體檢測(cè)技術(shù)的研究和報(bào)道較多，但對(duì)雞等禽類弓形蟲(chóng)感染檢測(cè)的研究較少。
　　本實(shí)驗(yàn)室對(duì)GRA8全基因進(jìn)行

3、了克隆表達(dá)，并進(jìn)行了Western blot和ELISA驗(yàn)證，表明GRA8是一種具有很好診斷價(jià)值的雞弓形蟲(chóng)病診斷抗原，但由于GRA8基因被正確插入原核表達(dá)質(zhì)粒中，原核重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸埃希菌中表達(dá)GRA8的水平低，所以本研究利用TMHMM、SignalP4.1和DNAstar等生物學(xué)軟件進(jìn)行了信號(hào)肽及疏水區(qū)預(yù)測(cè)，構(gòu)建了切除信號(hào)肽及疏水區(qū)的截短型sGRA8原核表達(dá)載體，通過(guò)Western blot驗(yàn)證表明該重組蛋白具有很好的抗原性，可以做

4、為雞弓形蟲(chóng)病的診斷抗原。大量表達(dá)、純化該重組蛋白后，進(jìn)行ELISA板包被，經(jīng)抗原包被量、一二抗、封閉液和底物等相關(guān)條件的摸索和優(yōu)化后，確定了sGRA8的最佳工作濃度為1.7μg/ml，陰、陽(yáng)性血清的最佳稀釋倍數(shù)為1∶10，二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶6000，sGRA8的最佳包被條件為37℃包被2h后4℃過(guò)夜，選用5％脫脂奶粉作為封閉液，最佳封閉時(shí)間為1h，抗體的反應(yīng)時(shí)間為1h，酶標(biāo)抗體最佳作用時(shí)間為1h，最佳顯色時(shí)間10min。用構(gòu)建的間接

5、ELISA抗體檢測(cè)法與RB公司的雞弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)試劑盒，對(duì)人工感染雞弓形蟲(chóng)7-130d的陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行平行抗體檢測(cè)的結(jié)果顯示:7～45d內(nèi)的符合率為98.26％，RB公司的試劑盒對(duì)60d后的血清無(wú)法檢出陽(yáng)性，而構(gòu)建的間接ELISA對(duì)7～130d的陽(yáng)性血清的檢測(cè)敏感度達(dá)到80％～100％，且對(duì)7種雞球蟲(chóng)、法氏囊、新城疫和大腸桿菌等雞常見(jiàn)病原體陽(yáng)性血清的檢測(cè)未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。所以本方法是一個(gè)敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的雞弓形蟲(chóng)檢測(cè)