促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景:腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的50％，其具有高發(fā)病率及致死率的特點(diǎn)。傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)，放療，化療，但治療效果仍較差，尤其是針對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，即使應(yīng)用上述綜合治療，其平均生存期尚不足14.6個月。隨著人們對膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識，神經(jīng)肽類物質(zhì)在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關(guān)注。促腎上腺激素釋放因子（corticotropin-releasing factor CRF）是一類最早由vale從羊下丘

2、腦中分離出的含有41個氨基酸的激素類神經(jīng)肽。主要分布于人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以下丘腦為著，外周系統(tǒng)中分布廣泛。CRF主要作用于下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)，調(diào)節(jié)機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下的內(nèi)分泌，自主神經(jīng)，免疫反應(yīng)等方面的協(xié)調(diào)。近年來，CRF作為一類重要的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，其在腫瘤方面的作用也逐漸被重視起來。CRF對其他系統(tǒng)腫瘤的作用表現(xiàn)在:CRF可以通過CRFR1的激活抑制乳腺癌細(xì)胞生長;CRF通過CRFR2的激活抑制人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長;尿皮素

3、通過CRFR2抑制肝細(xì)胞癌的腫瘤生長和血管的生成。但是，CRF對腦膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制國內(nèi)外鮮有報道。
　　目的:探索CRF對U87細(xì)胞凋亡的作用和在不同濃度的CRF作用下，對U87細(xì)胞中CRFR1，PCNA，caspase-3，cytC蛋白表達(dá)的影響及fas/fasl，Bcl-2/Bax基因表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1 CCK8法檢測U87細(xì)胞凋亡
　　復(fù)蘇U87細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每組置3個重復(fù)孔。3

4、7℃，5％CO2，濕化空氣培養(yǎng)24h后，更換入含有CRF的DMEM培養(yǎng)基(濃度分別為0，10-7，10-8，10-9mol/L)，設(shè)立空白對照組（不含CRF及細(xì)胞），在24h時間點(diǎn)加入cck-8(10ul/孔)，培養(yǎng)箱中作用3h后檢測細(xì)胞的OD值(450nm)。
　　2 Western-blot檢測CRFR1，PCNA，caspase-3，，cytC蛋白表達(dá)提取24h組細(xì)胞總蛋白，勻漿器勻漿，BCA法蛋白濃度定量，加入上樣緩沖液煮

5、沸5min，總蛋白60μg上樣到10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為205mA，1.5h。5％脫脂奶粉室溫封閉2h后，TBS漂洗3次，每次5分鐘。CRFR1(1∶500)，PCNA(1∶800)，caspase-3(1∶800)，cytC(1∶800)，β-actin(1∶500)在上述一抗溶液中4℃孵育過夜。TBS洗膜5min，羊抗兔二抗溶液中常溫孵育60min。化學(xué)發(fā)光儀中發(fā)光成像，并經(jīng)Image

6、J對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算蛋白相對值=蛋白A值/β-actin值。
　　3熒光定量PCR檢測fas/fasl，Bcl-2/Bax基因表達(dá)
　　Trizol法提取細(xì)胞總RNA，1.2％凝膠電泳檢測其完整性。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。應(yīng)用DNAman軟件設(shè)計(jì)fas/fasl，Bcl-2/Bax引物序列，由北京賽百盛公司合成。置于AB7300PCR儀，95℃變性5min;95℃變性30s，55℃退火1

7、5s，72℃延伸30s，40個循環(huán);最后，產(chǎn)物在72℃延伸5min。同時在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析，計(jì)算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個樣品相對于對照樣品目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，記錄結(jié)果數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1 CCK-8細(xì)胞凋亡檢測:不同濃度CRF處理的U87細(xì)胞凋亡率存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.79，P＜0.05)。
　　2 Western-b

8、lot檢測:CRFR1蛋白的實(shí)驗(yàn)組高于對照組，差異顯著(F=83.32，P＜0.05)。PCNA蛋白的實(shí)驗(yàn)組高于對照組，差異顯著(F=36.19，P＜0.05)。cytC蛋白的實(shí)驗(yàn)組高于對照組，差異顯著(F=11.93,P＜0.05)。caspase-3蛋白的實(shí)驗(yàn)組高于對照組，差異顯著(F=44.82，P＜0.05)。
　　3熒光定量PCR檢測: Bcl-2 mRNA的實(shí)驗(yàn)組低于對照組，差異顯著(F=138.82,P＜0.05)。

9、Bax mRNA的實(shí)驗(yàn)組高于對照組，差異顯著(F=215.25，P＜0.05）。不同濃度CRF干預(yù)的U87細(xì)胞Fas mRNA的表達(dá)不全相同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.5,P＜0.05)。不同濃度CRF處理的U87細(xì)胞Fasl mRNA的表達(dá)不全相同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=54.14,P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1 CCK8實(shí)驗(yàn)顯示CRF對膠質(zhì)瘤U87MG具有促進(jìn)凋亡的作用。
　　2 Western-blot印跡結(jié)果顯