草莓乙烯受體FaEtr2基因RNAi植物表達(dá)載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、草莓是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的果品，但果實(shí)采后極易軟化腐爛，不耐貯運(yùn)，造成很人的經(jīng)濟(jì)損失。乙烯受體FαEtr2基因在草莓果實(shí)成熟階段大量表達(dá)，可能與果實(shí)的成熟密切相關(guān)。深入研究FαEtr2基因功能將有助于揭示乙烯受體與非躍變型果實(shí)成熟的關(guān)系，從而為采用生物技術(shù)手段提高草莓果實(shí)的貯運(yùn)性能奠定基礎(chǔ)。為此，本研究以全明星草莓基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增到了草莓乙烯受體FαEtr2基因片段，構(gòu)建了該基因的反義和RNA干擾植物表達(dá)載體。以全明星草莓組

2、培苗葉片為試材，研究了基本培養(yǎng)基、激素配比、外植體生理狀態(tài)、苗齡、暗培養(yǎng)時間等，對草莓不定芽再生的影響，優(yōu)化了草莓再生條件，獲得了草莓高效再生體系。通過葉盤與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的方法建立了全明星草莓的遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了Kanamycin抗性植株。Gus化學(xué)組織染色和PCR檢測分析表明FαEtr2-RNAi基因已轉(zhuǎn)入全明星草莓植株。主要結(jié)果如下：
　　 (一)全明星草莓FαEtr2基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建
　　 (1)根據(jù)已發(fā)表

3、的Chandlar草莓乙烯受體FαEtr2的保守氨基酸序列，設(shè)計(jì)了一對特異性引物，PCR擴(kuò)增得到一個長1049bp的基因片段，序列分析表明該片段與GenBank中Chandlar草莓FαEtr2基因核苷酸序列及所編碼的氨基酸序列同源性高達(dá)100％，無內(nèi)含子序列。說明克降到的片段是全明星草莓FαEtr2基因片段。
　　 (2)將克隆到的全明星草莓FαEtr2核苷酸序列反向克隆到了pBI221質(zhì)粒的XbaI-BamHI酶切位點(diǎn)之間，

4、構(gòu)建成中間表達(dá)載體pBI221-anti-Etr2。用BamHI和HindIII酶切構(gòu)建好的中間載體pBI221-anti-Err2和pBI121質(zhì)粒，切下中間載體質(zhì)粒上的CaMV35S啟動子和FαEtr2的反義序列，將其定向插入到切除CaMV35S啟動子的pBI121質(zhì)粒中，構(gòu)建成反義表達(dá)載體pBI121-anti-Etr2。
　　 (3)將FαEtr2的序列正向插入到中間載體pBI221質(zhì)粒的BamHI和SmaI酶切位點(diǎn)之間

5、，構(gòu)建成中間表達(dá)載體pBI221-sense-Etr2。用EcoRI和HindIII酶切構(gòu)建好的反義表達(dá)載體pBI121-anti-Etr2和中問載體pBI221-sense-Etr2。切下中間載體質(zhì)粒上的GusA、NOS終止子和正義序列，將其插入到切除了GusA和NOS終止子的pBI121-anti-Etr2質(zhì)粒中，構(gòu)建成RNAi植物表達(dá)載體pBI121-Etr2-RNAi。
　　 (4)利用凍融法將pBI121-anti-E

6、tr2、pBI121-Etr2-RNAi兩個表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，經(jīng)特異性引物對轉(zhuǎn)化菌液的PCR擴(kuò)增，證實(shí)表達(dá)載體已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。
　　 (二)葉片再生體系的建立
　　 (1)對所試的三種基本培養(yǎng)基，MS(1/2N)、MS和1/2MS，MS(1/2N)基本培養(yǎng)基最好，分化率可達(dá)75.76％。30天和35天葉齡的葉片外植體分化率高，分別為58.62％和58.86％。以幼嫩葉片為外植體，分化率和平均不定芽位點(diǎn)數(shù)

7、分別為35.71％和0.46，顯著高于老葉片處理(分化率和平均不定芽位點(diǎn)數(shù)分別為19.23％和0.23)，二者的玻璃化率差異不顯著。
　　 (2)隨著TDZ濃度的升高，葉片分化率、平均不定芽位點(diǎn)數(shù)都呈上升趨勢，同時玻璃化率也呈上升趨勢。TDZ1.0mg·L-1和1.5mg·L-1處理葉片分化率(分別為32.98％和36.67％)、平均不定芽位點(diǎn)數(shù)(分別為0.42和0.47)均較高，但TDZ1.5mg·L-1處理的玻璃化率顯著高于

8、TDZ1.0mg·L-1處理。綜合考慮確定TDZ1.0mg·L-1為全明星草莓葉片再生的適宜濃度。
　　 (3)IBA和NAA都是在濃度為0.05mg·L-1時再生效果最好，葉片分化率分別為68.99％和38.93％。0.05mg·L-1的IBA和1.0mg·L-1的TDZ配合使用是適用于的全明星草莓葉片再生的最佳激素處理。較高濃度的NAA(0.2mg·L-1～0.3mg·L-1)處理中，再生的不定芽玻璃化率較高。同水平的IBA

9、與TDZ組合，葉片分化率、平均不定芽位點(diǎn)數(shù)和平均每葉片再生不定芽數(shù)均顯著高于NAA與TDZ組合。
　　 (4)不經(jīng)暗培養(yǎng)的葉片再生頻率較低，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，葉片分化率和平均不定芽位點(diǎn)數(shù)都呈上升趨勢，暗培養(yǎng)9天和12天的葉片分化率分別為40.54％和34.29％，顯著高于其他處理。
　　 (三)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 (1)Cef200mg·L-1時組培苗植株及側(cè)芽生長都基本正常，達(dá)到或超過300mg·L-

10、1植株生長及側(cè)芽分化都受到明顯抑制。200mg·L-1Cef可基本抑制農(nóng)桿菌的生長。Km20mg·L-1可抑制非轉(zhuǎn)化芽分化，可用于抗性不定芽篩選。
　　 (2)農(nóng)桿菌LBA4404在菌液濃度為OD600=0.5左右時，菌體增殖最快；預(yù)培養(yǎng)3天的葉片抗性不定芽生成率最高，為18.9％，與其他預(yù)培養(yǎng)時間處理間差異極顯著；附加10mg·L-1或20mg·L-1的AS，抗性不定芽的分化率從7.53％分別提高到15.09％和14.55％。

11、
　　 (3)用OD600為1.0重懸菌液侵染葉片比用OD600為0.5的原菌液侵染效果好，抗性不定芽分化率由6.15％提高到15.8％；用不同濃度的重懸菌液侵染葉片，OD600為1.0時效果最好，抗性不定芽生成率為18.55％。適宜的浸染時間為10min，抗性不定芽生成率最高，為21.46％。
　　 (4)不同共培養(yǎng)時間和脫菌培養(yǎng)時間的組合以共培養(yǎng)3天，脫菌培養(yǎng)3天的葉片分化率、抗性不定芽位點(diǎn)數(shù)、每葉盤不定芽數(shù)最高，分