大腫瘤基因tml的RNAi載體構建及其對毛白楊的遺傳轉化.pdf

1、RNAi是最近幾年發(fā)展起來的研究生物體基因表達調控與功能的一項嶄新的基因沉默技術，是由小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物細胞內同源基因的特異沉默(silencing)現象，其本質是siRNA與對應的mRNA特異結合，使其降解，從而阻止了mRNA的翻譯。 植物根癌病世界各地均有發(fā)生，在我國也廣泛的存在。其病原致瘤農桿菌[Agrobacteriumtume faciens(Smithet

2、Towns)Corm對林木、果樹、園林花卉等植物均具有廣泛的致病性。楊樹是我國北方重要的城市綠化和造林樹種，是致瘤農桿菌危害林木樹種之一。在受到農桿菌侵染后，植株的根部、根莖處甚至莖上形成大小不一的腫瘤，感病植株生長遲緩，樹勢弱，產量少，壽命短，降低木材產量的同時，也帶來了巨大的經濟損失。因此采用先進的技術手段，從基因工程的角度來抑制腫瘤發(fā)生，研究腫瘤發(fā)生機制，這對于植物根癌病的防治、癭木的開發(fā)利用等均具有重要的理論和應用價值。

3、 以野生根癌農桿菌I型中克隆得到的523bp長度的tml基因為目的基因，利用中間克隆載體pD12，以289bp的pBR322部分序列為間隔區(qū)，使tml反義基因片段、PBR322和tml正義基因片段串聯，將構成的全長1300bp的DNA片段插入植物雙元載體pCAMBIA1302中，成功構建基因tml的RNAi載體pHR2122-1302，此可讀框架通過組成型啟動子CaMV35S啟動，另外此載體帶有真核內含子的GFP標記基因，轉基因植物可通

4、過熒光鑒定。 選用培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L附加蔗糖3％，瓊脂0.6％作為毛白楊雄株遺傳轉化用的芽分化培養(yǎng)基，之后接種到生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA0.5mg/L+1.5％蔗糖+6g/L瓊脂上利于植株生根。利用野生農桿菌侵染植株，并通過PCR技術對轉基因植株插入基因iaaH、tml的檢測和對冠癭堿的檢測，確定得到3株野生農桿菌轉化植株。 通過分析影響遺傳轉化效率的因素，確立高效遺傳轉化

5、體系，侵染時間控制在5-10min，共培養(yǎng)2-3天，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中去除COCl<,2>·6H<,2>O，卡那霉素選擇壓為50mg/L。 以根癌農桿菌介導的葉盤轉化法將植物雙元載體pHR2122-1302轉化入毛白楊雄株-D，通過50mg/L卡那霉素篩選和GFP檢測，獲得了轉基因植株，轉基因植株在形態(tài)上有一定程度的變異，具體數據以及其對外源野生農桿菌的影響正在進一步檢測當中。 對室外瘤體的研究發(fā)現，tml-RNAi載體對瘤