HER-2對胃癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、胃癌是一嚴(yán)重危害著全世界人民健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)占所有癌癥的7.8％，居全球腫瘤發(fā)病率及病死率的第2位，我國也是胃癌高發(fā)區(qū)。由于胃癌早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于進(jìn)展期，甚至已發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。浸潤轉(zhuǎn)移是胃癌主要的致死性原因，因此探明其浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制，為發(fā)展新的治療策略提供有力的理論依據(jù)而顯得尤為迫切和重要。
　　 HER-2又稱neu、ErbB-2、C-erbB-2或P185，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的

2、跨膜糖蛋白，為EGFRs家族的一員，通常只在胎兒時(shí)期表達(dá)，成年后只出現(xiàn)在少數(shù)正常組織中。在正常情況下，HER-2表達(dá)非常低，可參與細(xì)胞生長、增殖和分化的調(diào)節(jié)。當(dāng)受到某些致癌因素作用后，其結(jié)構(gòu)或表達(dá)失控而被激活，促使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并加速腫瘤細(xì)胞運(yùn)動，導(dǎo)致腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，HER-2在胃癌中存在過表達(dá)或基因擴(kuò)增現(xiàn)象，影響胃癌患者的預(yù)后，也可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及胃癌肝轉(zhuǎn)移過程。
　　 人類Fa

3、scin1基因?qū)儆贔ascin家族，編碼產(chǎn)物為分子量55KD、是能與F-肌動蛋白結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)張力纖維和細(xì)胞膜皺褶(ruffles)邊緣的絲狀偽足、微棘(microspikes)的核心肌動蛋白束中，而細(xì)胞形成的偽足和微棘與細(xì)胞運(yùn)動、癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。Fascin1蛋白在正常神經(jīng)組織中表達(dá)，而在上皮細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)在一些上皮組織腫瘤如乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌等中常表達(dá)上調(diào)，盡管在胃癌患者中

4、Fascin1表達(dá)率不高（25％），但它的表達(dá)與胃癌的浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。
　　 Twist屬于堿性的螺旋-環(huán)-螺旋（Basichelix loop helix，bHLH)蛋白家族中的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白分子量為26 kD，在胎盤和中胚層來源的組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，廣泛參與調(diào)控器官生長發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖分化等過程。最近Twist被認(rèn)為是癌基因蛋白，影響腫瘤細(xì)胞的凋亡，并作為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型(ep

5、ithel ial-mesenchymaltransition，EMT)過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有重要影響。近幾年研究表明Twist與胃癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。
　　 目的:研究HER-2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移特性的影響，探討HER-2基因與促腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移分子如Fascin1和Twist的相互關(guān)系，為HER-2作為靶的胃癌基因治療提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

6、 方法:
　　 1.培養(yǎng)胃癌細(xì)胞SGC7901、BGC823、MKN45。
　　 2.利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒HER-2(CA)，HER-2(KD)，HER-2(WT)和空白質(zhì)粒載體(PCDNA3)到MKN45細(xì)胞和SGC7901細(xì)胞，以空白質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染組為陰性對照，以空白轉(zhuǎn)染組（本底細(xì)胞）為空白對照。
　　 3.利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)，分別轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒Neu-shRNA，Control-shRNA

7、于BGC823細(xì)胞，以空白質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染組為陰性對照，以空白轉(zhuǎn)染組（本底細(xì)胞）為空白對照。
　　 4.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）法檢測不同轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞，MKN45細(xì)胞，BGC823細(xì)胞的HER-2和Fascin1的mRNA水平，并分析HER-2和Fascin1的相關(guān)性。
　　 5.用Western blotting的方法比較不同轉(zhuǎn)染組SGC7901細(xì)胞，MKN45細(xì)胞，BGC823細(xì)胞HE

8、R-2，F(xiàn)ascin1，Twist和E-cadherin的蛋白表達(dá)，并分其相關(guān)性。
　　 6.用Transwell侵襲小室，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):檢測轉(zhuǎn)染HER-2(CA), HER-2(WT)質(zhì)粒后MKN45細(xì)胞侵襲遷移能力變化;檢測轉(zhuǎn)染Neu-shRNA, Control-shRNA質(zhì)粒后BGC823細(xì)胞侵襲遷移能力變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組（Control-sh

9、RNA-BGC823）和未轉(zhuǎn)染組BGC823細(xì)胞相比，在干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（Neu-shRNA-BGC823）細(xì)胞中，HER-2和Twist表達(dá)下調(diào)(P＜0.05), E-cadherin表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，F(xiàn)ascin1表達(dá)無變化(P＞0.05)。
　　 2.與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組PCDNA3-MKN45和未轉(zhuǎn)染組MKN45細(xì)胞相比，在質(zhì)粒（HER-2CA，HER-2KD，HER-2WT）轉(zhuǎn)染組HER-2-MKN45細(xì)胞中，H

10、ER-2和Twist表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，F(xiàn)ascin1表達(dá)無變化(P＞0.05)，同時(shí)在另外一株胃癌細(xì)胞株SGC7901中得到相同的結(jié)論。
　　 3.與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組(Control-shRNA-BGC823)和未轉(zhuǎn)染組BGC823細(xì)胞相比，干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(Neu-shRNA-BGC823)細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力明顯降低(P＜0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組

11、細(xì)胞的愈合能力明顯減弱(P＜0.05)。
　　 4.與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照組PCDNA3-MKN45和未轉(zhuǎn)染組MKN45細(xì)胞相比，質(zhì)粒(HER-2CA，HER-2WT)轉(zhuǎn)染組HER-2-MKN45細(xì)胞遷移能力和侵襲能力明顯增加(P＜0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，HER-2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的愈合能力明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HER-2增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
　　 2.HER-2