黑米花青素抗HER-2陽性乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移及分子機制研究.pdf

1、目的:近年，流行病學、臨床研究和動物腫瘤模型資料均表明膳食花青素對多種慢性疾病均有防治作用，而對腫瘤的防治效應(yīng)備受研究者關(guān)注。已有研究證實，人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)過量表達乳腺癌患者的癌細胞增殖快，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。課題組前期研究表明，源于黑米皮中的花青素(black rice anthocyanins，BRACs)能通過下調(diào)HER-2磷酸

2、化水平，抑制HER-2陽性乳腺癌細胞的生長、增殖，并促進癌細胞凋亡，但花青素中有效成分如何與靶點HER-2作用仍不明了。(1)本研究首先用分子對接方法預(yù)測花青素主要成分與HER-2的相互作用位點并探究作用機制。(2)然后，進一步研究BRACs對HER-2陽性乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。(3)最后，探究BRACs對HER-2介導(dǎo)的主要通路之一PI3K通路的影響。
　　方法:(1)首先，利用分子對接軟件MVD(Molecular V

3、irtual Docker5.5)，以HER-2激酶區(qū)(HER2TK)為受體模板建立活性位點，與12種花青素組分及ATP共13種化合物進行對接，探尋花青素與受體HER-2相互作用位點，并研究花青素抑制HER-2磷酸化機制。(2)然后，用BRACs處理乳腺癌細胞后，流式細胞儀檢測細胞存活率;粘附和劃痕實驗觀察細胞粘附和遷移能力;Millicell和基質(zhì)膠侵襲實驗觀察細胞形變運動和侵襲能力。(3)最后，用比色法和明膠酶譜法分析促轉(zhuǎn)移酶u-P

4、A和MMP-2/-9的活性;Western Blot法檢測蛋白表達變化;免疫共沉淀法分析蛋白質(zhì)間相互作用。
　　結(jié)果:(1)12種花青素組分均能在HER-2激酶區(qū)同一活性腔中對接(MolDockScore:苷元＜-105 kJ/mol，單葡糖苷＜-130 kJ/mol)，主要作用力是疏水作用和氫鍵，糖苷比苷元結(jié)合更緊密。推測花青素與HER2TK的結(jié)合位點主要取決于母核結(jié)構(gòu)，糖的結(jié)合能增加花青素與HER-2激酶區(qū)結(jié)合的穩(wěn)定性。對比結(jié)

5、合位點發(fā)現(xiàn)，ATP與花青素在HER-2激酶區(qū)對接位點相同，但結(jié)合能稍低(MolDock Score:-161 kJ/mol)。推測花青素能通過干擾氫鍵形成，競爭性抑制ATP與HER-2結(jié)合，調(diào)節(jié)HER-2磷酸化水平，從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)。
　　(2) BRACs對乳腺癌細胞MDA-MB-453和MCF-7的24小時IC50分別為354.95μg/mL和652.57μg/mL。但正常乳腺MCF-10A細胞則表現(xiàn)為耐受，可能是由于花青素與

6、HER-2結(jié)合穩(wěn)定性低于ATP，因此在發(fā)揮抗癌效應(yīng)時對正常細胞具有保護效應(yīng)。BRACs處理后，乳腺癌細胞MDA-MB-453的粘附、遷移、形變運動和基質(zhì)膠降解能力均降低(P＜0.05）。
　　(3) BRACs作用后，促轉(zhuǎn)移酶u-PA和MMP-2/-9活性降低，MMP-2在胞漿中積累顯著減少;Akt、mTOR、p70S6K、eIF4E分子磷酸化水平均降低;Akt/mTOR/p70S6K、PDK/mTOR/p70S6K分子間相互作用