黑米花青素抗HER-2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:近年，流行病學(xué)、臨床研究和動(dòng)物腫瘤模型資料均表明膳食花青素對(duì)多種慢性疾病均有防治作用，而對(duì)腫瘤的防治效應(yīng)備受研究者關(guān)注。已有研究證實(shí)，人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)過(guò)量表達(dá)乳腺癌患者的癌細(xì)胞增殖快，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。課題組前期研究表明，源于黑米皮中的花青素(black rice anthocyanins，BRACs)能通過(guò)下調(diào)HER-2磷酸

2、化水平，抑制HER-2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，但花青素中有效成分如何與靶點(diǎn)HER-2作用仍不明了。(1)本研究首先用分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)花青素主要成分與HER-2的相互作用位點(diǎn)并探究作用機(jī)制。(2)然后，進(jìn)一步研究BRACs對(duì)HER-2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。(3)最后，探究BRACs對(duì)HER-2介導(dǎo)的主要通路之一PI3K通路的影響。
　　方法:(1)首先，利用分子對(duì)接軟件MVD(Molecular V

3、irtual Docker5.5)，以HER-2激酶區(qū)(HER2TK)為受體模板建立活性位點(diǎn)，與12種花青素組分及ATP共13種化合物進(jìn)行對(duì)接，探尋花青素與受體HER-2相互作用位點(diǎn)，并研究花青素抑制HER-2磷酸化機(jī)制。(2)然后，用BRACs處理乳腺癌細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活率;粘附和劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞粘附和遷移能力;Millicell和基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞形變運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。(3)最后，用比色法和明膠酶譜法分析促轉(zhuǎn)移酶u-P

4、A和MMP-2/-9的活性;Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)變化;免疫共沉淀法分析蛋白質(zhì)間相互作用。
　　結(jié)果:(1)12種花青素組分均能在HER-2激酶區(qū)同一活性腔中對(duì)接(MolDockScore:苷元＜-105 kJ/mol，單葡糖苷＜-130 kJ/mol)，主要作用力是疏水作用和氫鍵，糖苷比苷元結(jié)合更緊密。推測(cè)花青素與HER2TK的結(jié)合位點(diǎn)主要取決于母核結(jié)構(gòu)，糖的結(jié)合能增加花青素與HER-2激酶區(qū)結(jié)合的穩(wěn)定性。對(duì)比結(jié)

5、合位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，ATP與花青素在HER-2激酶區(qū)對(duì)接位點(diǎn)相同，但結(jié)合能稍低(MolDock Score:-161 kJ/mol)。推測(cè)花青素能通過(guò)干擾氫鍵形成，競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP與HER-2結(jié)合，調(diào)節(jié)HER-2磷酸化水平，從而發(fā)揮抗癌效應(yīng)。
　　(2) BRACs對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453和MCF-7的24小時(shí)IC50分別為354.95μg/mL和652.57μg/mL。但正常乳腺M(fèi)CF-10A細(xì)胞則表現(xiàn)為耐受，可能是由于花青素與

6、HER-2結(jié)合穩(wěn)定性低于ATP，因此在發(fā)揮抗癌效應(yīng)時(shí)對(duì)正常細(xì)胞具有保護(hù)效應(yīng)。BRACs處理后，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453的粘附、遷移、形變運(yùn)動(dòng)和基質(zhì)膠降解能力均降低(P＜0.05）。
　　(3) BRACs作用后，促轉(zhuǎn)移酶u-PA和MMP-2/-9活性降低，MMP-2在胞漿中積累顯著減少;Akt、mTOR、p70S6K、eIF4E分子磷酸化水平均降低;Akt/mTOR/p70S6K、PDK/mTOR/p70S6K分子間相互作用