TGFβ1對(duì)胃癌細(xì)胞耐藥的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、一、前言胃癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤,在我國(guó)是死亡率最高的惡性腫瘤之一。目前胃癌的治療一般采用手術(shù)、化療、放療、免疫治療等綜合措施,其中化療具有手術(shù)和放療不能替代的地位。但腫瘤細(xì)胞的耐藥性,尤其是腫瘤的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)常導(dǎo)致化療失敗。據(jù)統(tǒng)計(jì),晚期胃癌患者化療有效率約為20％~40%,生存率平均6~12個(gè)月。腫瘤多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞接觸一種化療藥物并對(duì)其產(chǎn)生耐藥后,同時(shí)對(duì)其它化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同

2、的化療藥物亦產(chǎn)生耐藥。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor beta,TGFβ)超家族是一類結(jié)構(gòu)相似但功能不同的肽類物質(zhì),在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中,其作用機(jī)制較為復(fù)雜。我們的早期研究發(fā)現(xiàn)TGFβ1除了明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移外,還可顯著增加SGC-7901細(xì)胞中谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶π(GST-π)的表達(dá),且胃癌組織中TGFβ1與GST-π的表達(dá)水平呈正相關(guān)。有研究表明,GST-π表達(dá)水平的改變與化療耐藥有關(guān),由

3、此提示TGFβ1可能參與了胃癌細(xì)胞的耐藥過(guò)程,但迄今為止尚未見(jiàn)TGFβ1與胃癌耐藥相關(guān)的報(bào)道。
　　二、目的：本課題以TGFβ1處理SGC-7901細(xì)胞,觀察其對(duì)化療藥物敏感性的變化,然后利用siRNA、蛋白質(zhì)組學(xué),Western blotting等技術(shù)分析可能參與此過(guò)程的信號(hào)分子,以探討TGFβ1促胃癌耐藥的分子機(jī)制,為臨床克服耐藥現(xiàn)象提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　三、方法與結(jié)果：1、利用MTT法檢測(cè)經(jīng)TGFβ1預(yù)處理過(guò)的SGC

4、-7901和未經(jīng)TGFβ1預(yù)處理過(guò)的SGC-7901對(duì)絲裂霉素的敏感性,結(jié)果發(fā)現(xiàn):絲裂霉素對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率為89.5±10.6%;經(jīng)10ng/ml TGFβ1預(yù)處理后,絲裂霉素對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率降為35.0±4.1%,二者間有顯著性差異(反應(yīng)細(xì)胞增殖情況OD490值的比較,均P<0.05)。表明TGFβ1預(yù)處理可降低SGC-7901細(xì)胞對(duì)絲裂霉素的敏感性,誘導(dǎo)其對(duì)絲裂霉素耐藥。表明TGFβ1能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥

5、性。2、運(yùn)用Hoechst 33258熒光染色法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了TGFβ1處理前后SGC-7901細(xì)胞凋亡率的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGFβ1處理對(duì)SGC-7901細(xì)胞的凋亡率無(wú)影響。3、采用高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),通過(guò)二維凝膠電泳技術(shù)分析經(jīng)TGFβ1預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞和未處理的SGC-7901細(xì)胞的差異蛋白表達(dá)譜,結(jié)合基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)初步鑒定差異蛋白,以初步探討TGFβ1誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞耐藥的作用機(jī)制

6、。比較兩組細(xì)胞總蛋白的2-D圖譜后,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,它們蛋白質(zhì)點(diǎn)的分布十分相似,位置重復(fù)性分析表明TGFβ1處理SGC-7901細(xì)胞在等電聚焦(IEF)方向上的平均偏差為0.908±0.102mm,在垂直板SDS-PAGE電泳方向上的平均位置偏差為1.032±0.108mm;未處理SGC-7901細(xì)胞在IEF方向上的平均偏差為0.838±0.116 mm,在垂直板SDS-PAGE電泳方向上的平均位置偏差為1.075±0.168 mm

7、。表明我們成功地建立了分辨率較高,重復(fù)性較好的TGFβ1預(yù)處理SGC-790l細(xì)胞和未處理SGC-7901細(xì)胞的二維凝膠電泳圖譜。使用PDquest分析軟件對(duì)TGFβ1預(yù)處理SGC-7901細(xì)胞和未處理SGC-7901細(xì)胞的各蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)豐度進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)30個(gè)差異點(diǎn),隨機(jī)選取2個(gè)差異點(diǎn),經(jīng)原位酶解和MALDI-TOF質(zhì)譜分析測(cè)定它們的PMF,初步鑒定了其中的2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。部分候選的蛋白質(zhì)差異表達(dá)水平經(jīng)Western blotti

8、ng分析可以看出SGC-7901細(xì)胞經(jīng)TGFβ1處理后GST-π,MDR1蛋白表達(dá)上調(diào),這些結(jié)果與我們蛋白質(zhì)組學(xué)的分析結(jié)果是一致的。4、應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)TGFβ1、GST-π和MDR1在胃癌組織中的表達(dá)情況并分析其與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系。結(jié)果表明:TGFβ1、GST-π和MDR1的陽(yáng)性信號(hào)主要在細(xì)胞漿。在76例胃癌組織中,TGFβ1、GST-π和MDR1的陽(yáng)性率分別為75%、81.5%及61.8%,且三種蛋白的表達(dá)均與分化程度、

9、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),但與年齡和性別等無(wú)關(guān)(P>0.05)。5、利用Smad4 siRNA、MAPK通路特異性阻斷劑處NSGC-7901細(xì)胞,然后分別檢測(cè)GST-π、MDR1的表達(dá)水平,以期明確TGFβ1上調(diào)GST-π、MDR1表達(dá)的信號(hào)途徑。結(jié)果表明:TGFβ1作用SGC-7901細(xì)胞后GST-π的表達(dá)水平明顯上調(diào),但經(jīng)Smad4 siRNA及PD98059預(yù)處理后,其表達(dá)水平隨之降低;而在SB203580及SP6

10、00125處理組GST-π的表達(dá)水平無(wú)明顯變化,提示TGFβ1可能通過(guò)經(jīng)典Smad通路及ERK途徑誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞GST-π的表達(dá)。而利用外源性TGFβ1處理胃癌細(xì)胞SGC-7901,探討其對(duì)SGC-7901細(xì)胞MAPK通路的影響時(shí)亦發(fā)現(xiàn),SGC-7901的p-ERK表達(dá)水平上調(diào),這亦再次表明ERK通路在此分子事件中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中,我們亦發(fā)現(xiàn)TGFβ1作用SGC-7901細(xì)胞后MDR1的表達(dá)明顯上調(diào),但在經(jīng)SP60

11、0125及PD98059預(yù)處理后,其表達(dá)水平隨之降低;而在SB203580及Smad4 siRNA處理組MDR1的表達(dá)水平無(wú)明顯變化,這就提示TGFβ1可能通過(guò)JNK通路及ERK途徑誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞MDR1的表達(dá)。而利用外源性TGFβ1處理胃癌細(xì)胞SGC-7901,探討其對(duì)SGC-7901細(xì)胞MAPK通路的影響時(shí)亦發(fā)現(xiàn),SGC-7901的p-ERK、p-JNK表達(dá)水平上調(diào),這亦再次表明ERK、JNK通路在此分子事件中發(fā)揮了重要作