SV40 PolyA正、反序列均可以減低L1-ORF2、L1-ORF2as、Alu14序列對(duì)GFP報(bào)告基因的抑制.pdf

1、目的：在人類基因組中，有98％的DNA序列屬于非編碼序列。非編碼序列中大約有一半的序列屬于重復(fù)序列，主要的重復(fù)序列類型有長(zhǎng)散在核元件(long interspersed nuclearelements，LINEs)、短散在核元件(short interspersed nuclearelements，SINEs)和長(zhǎng)末段重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)等，其中的LINEs包括LINE1(L1)和LINE2(L2

2、)，SINEs主要包括Alu家族(Alu family)。L1重復(fù)序列和Alu分別占據(jù)了人類基因組的16.9％和9.9％，兩者是人類基因組中最主要的重復(fù)序列。L1序列中蘊(yùn)藏著重要的遺傳和分化信息，在容易失活的基因、等位排斥基因及其側(cè)翼存在較多的L1序列，比如免疫細(xì)胞的B細(xì)胞受體基因，T細(xì)胞受體基因，細(xì)胞因子中的白介素2基因等。另外L1與基因表達(dá)調(diào)節(jié)，腫瘤發(fā)生，個(gè)體發(fā)育，生物進(jìn)化等有關(guān)。 Alu家族是一組廣泛分布的，300bp大小

3、的重復(fù)序列，在人類單倍體基因組中約有100萬(wàn)個(gè)Alu(包括不完整的重復(fù)序列)，是含量次多的重復(fù)序列。Alu與多種生物學(xué)現(xiàn)象有關(guān)，包括腫瘤發(fā)生，染色體重組，翻譯調(diào)節(jié)。研究表明，Alu與免疫系統(tǒng)也具有密切相關(guān)性。Alu序列可能被一些正向的順式調(diào)節(jié)元件所識(shí)別，比如人類的CD8 α基因T細(xì)胞特異性的增強(qiáng)子。Hambor等研究證實(shí)CD8 α基因中最后一個(gè)內(nèi)含子中的Alu插入片段起到增強(qiáng)子作用。已知L1有l(wèi)O個(gè)家族(L1M4，L1M3，L1M2，L

4、1M1，L1P5，L1P4，LIP3，LIP2，L1P1和Hs)。根據(jù)其開(kāi)放閱讀框2(openedreading frame2.ORF2)和3'非翻譯區(qū)同源性進(jìn)行分類，這10個(gè)家族又可以分為75種亞類(亞家族)，Hart等發(fā)現(xiàn)將L1ORF2(來(lái)自于L1家族中的L1.2亞家族)插入報(bào)告基因下游可以下調(diào)EGFP(Enhanced green fluorescent protein，增強(qiáng)性綠色熒光蛋白，簡(jiǎn)稱GFP)表達(dá)，那么其他家族成員是否也

5、有類似表現(xiàn)還尚且不明，而且GFP基因?yàn)楹螘?huì)受到下游插入L1.2序列的影響目前也仍屬未知。本文中我們將來(lái)自另外一個(gè)亞家族成員L1PA3的ORF2按不同方向以及14個(gè)Alu重復(fù)序列串聯(lián)裝入pEGFP-C1質(zhì)粒中(分別簡(jiǎn)稱p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，鏡下觀察GFP熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，以研究不同種類的重復(fù)序列對(duì)GFP報(bào)告基因表達(dá)的影響。 考慮到其抑制作用可能存在多種機(jī)制，為了更好的了解非編碼重

6、復(fù)序列對(duì)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的分子作用機(jī)理，我們?cè)跇?gòu)建好的質(zhì)?；A(chǔ)上插入猴巨細(xì)胞病毒早期蛋白多聚腺苷酸加尾信號(hào)(simian virus40 polyadenylation signal，SV40PolyA，簡(jiǎn)稱PolyA)正、反序列(240bp)以觀察PolyA及PolyAas對(duì)p-ORF2、p-ORF2as、p-Alu14中GFP熒光報(bào)告基因的影響。 方法： 1 構(gòu)建p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14重組質(zhì)粒PC

7、R擴(kuò)增RP11克隆上L1PA3的ORF2，在引物設(shè)計(jì)合適的限制性核酸內(nèi)切酶切位點(diǎn)。經(jīng)酶切后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物ORF2、ORF2as分別裝入pEGFP-Cl質(zhì)粒GFP下游MCS(p-ORF2，p-ORF2as)。PCR擴(kuò)增RP11克隆上的Alu，在引物設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，根據(jù)Xba Ⅰ和NheⅠ酶切位點(diǎn)可以連接不能切斷的特性，反復(fù)串聯(lián)構(gòu)建出含有14個(gè)Alu的表達(dá)載體(p-Alu14)。 2 構(gòu)建插入polyA正、反序列的重組質(zhì)粒PC

8、R擴(kuò)增pEGFP-Cl質(zhì)粒的PolyA，在上、下游引物設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)，在P-ORF2，P-ORF2as，p-Alu14質(zhì)粒中的GFP基因下游按正、反方向插入PolyA，分別命名為P-A-ORF2，p-A-ORF2as，p-A-Alu14，P-Aas-ORF2，p-Aas-ORF2as，p-Aas-Alu14。 3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和熒光觀察將構(gòu)建好的質(zhì)粒用Lipofectamine<'TM>2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體

9、pEGFP-Cl和未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞做為對(duì)照，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)觀察GFP熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，白光下計(jì)數(shù)同樣視野的細(xì)胞總數(shù)(每個(gè)樣本至少500個(gè))，計(jì)算熒光陽(yáng)性細(xì)胞百分率。在白光和熒光下分別對(duì)同一視野照相。 結(jié)果： 1 插入序列均不同程度抑制GFP熒光將P-ORF2，P-ORF2as，P-Alu14三個(gè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，24小時(shí)后觀察熒光細(xì)胞陽(yáng)性率。通過(guò)熒光計(jì)數(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，P-ORF2(0.47±0.10)％，P-OR

10、F2as(3.72±0.58)％，P-Alul4(0.03±0.05)％三者熒光表達(dá)率均明顯低于pEGFP-Cl質(zhì)粒熒光表達(dá)率(35.93±1.81)％。在GFP下游插入不同序列對(duì)熒光抑制程度不同：Alu14抑制作用最強(qiáng)，ORF2次之，ORF2as最弱。未轉(zhuǎn)染的HeLa無(wú)熒光表達(dá)。 2 PolyA正、反序均可以上調(diào)受抑制的GFP基因當(dāng)p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14三個(gè)質(zhì)粒的GFP下游插入正序PolyA后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H

11、eLa細(xì)胞24h后觀察熒光細(xì)胞，計(jì)數(shù)并計(jì)算熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。三種質(zhì)粒熒光表達(dá)率分別為：p-A-ORF2(7.69±0.55)％，P-A-ORF2as(11.2±1.14)％，p-A-Alul4(3.94+0.26)％。均高于對(duì)應(yīng)的未插入PolyA的p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14。 當(dāng)p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14三個(gè)質(zhì)粒的GFP下游插入反序PolyA后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞24h后觀察熒光細(xì)胞，計(jì)數(shù)并

12、計(jì)算熒光細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。三種質(zhì)粒熒光表達(dá)率分別為：p-Aas-ORF2(9.15±0.77)％，p-Aas-ORF2as(15.24±0.88)％，p-Aa--Alu14(5.67±0.59)％。均高于對(duì)應(yīng)的未插入PolyAas的p-ORF2，p-ORF2as，p-Alu14。 結(jié)論： 1 在GFP基因下游插入長(zhǎng)度相同的LIORF2，ORF2as，Alu14后，與pEGFP-Cl相比較，三者均下調(diào)GFP的表達(dá)。 2