MicroRNA與Forkhead家族基因在黃鱔性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的調(diào)控作用.pdf

1、MicroRNA（簡(jiǎn)稱miRNA）是一類進(jìn)化上高度保守的小分子非編碼RNA，長(zhǎng)度大約為22 nt，結(jié)合于靶基因的3'非翻譯區(qū)(UTR)，具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)和翻譯的功能。miRNA在不同物種中發(fā)揮著多種生物學(xué)功能，包括機(jī)體發(fā)育，神經(jīng)調(diào)控，細(xì)胞增殖與凋亡，脂肪生成與代謝和造血作用等，本研究的內(nèi)容主要集中于miRNA及其所涉及的生物學(xué)途徑在性腺分化和生殖細(xì)胞的發(fā)育等方面的作用。
　　黃鱔（Monopterus albus）在發(fā)育的的

2、過(guò)程中，具有由雌到雄的自然轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象。為了研究其性逆轉(zhuǎn)的生理機(jī)制，本研究利用深度測(cè)序的方法鑒定出性腺不同發(fā)育階段（雌性，間性和雄性）黃鱔腦、肝臟和性腺中160個(gè)成熟的miRNA，其中黃鱔Let-7家族、miR-10b、miR-143、miR-26a、miR-21、miR-181a和miR-9具有較高的表達(dá)量;48個(gè)miRNA在黃鱔性腺不同發(fā)育階段具有顯著的表達(dá)差異，其中9個(gè)miRNA在兩兩之間超過(guò)8倍以上的表達(dá)差異，黃鱔miR-430家

3、族成員均表現(xiàn)出顯著的表達(dá)差異，預(yù)測(cè)了黃鱔miR-430的靶基因，通過(guò)Ingenuity PathwayAnalysis(IPA)分析了黃鱔miR-430靶基因間的相互關(guān)系，主要涉及到生殖系統(tǒng)發(fā)育等一些生物學(xué)過(guò)程。
　　為了深入研究miR-430家族在魚類性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的作用，選擇硬骨魚類性別決定與分化的研究的模式動(dòng)物—青鳉（Oryzias latipes）作為一個(gè)比較研究的對(duì)象。檢測(cè)了青鳉成魚雌雄間miR-430家族的表達(dá)量，雌雄間

4、的表達(dá)量差異從腦、肝臟到性腺逐漸擴(kuò)大。再分別利用性激素17β-Estradiol和17β-Trenbolone對(duì)受精后5d(5dpf)的胚胎進(jìn)行7d的暴露試驗(yàn)，暴露后青鳉miR-430b的表達(dá)量升高。同時(shí)，預(yù)測(cè)了黃鱔和青鳉miR-430家族與靶基因foxl2的調(diào)控關(guān)系，并用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示:黃鱔miR-430b結(jié)合于黃鱔foxl2基因的3'UTR區(qū)域。而青鳉中可能由于過(guò)短的foxl23'UTR，避免了一些miRNA對(duì)其

5、的調(diào)控，如miR-430家族。因此我們推測(cè)黃鱔miR-430家族可能是通過(guò)調(diào)控foxl2的和其他性別決定基因的表達(dá)從而影響黃鱔的性逆轉(zhuǎn)。
　　Forkhead基因家族進(jìn)化分析認(rèn)為，foxl2在許多硬骨魚類中存在不同的拷貝，分別為foxl2a(foxl2)和foxl2b(foxl3)。因此我們推測(cè)黃鱔中存在foxl3拷貝并通過(guò)RACE方法克隆得到黃鱔foxl3序列，foxl3基因開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)795bp，編碼264個(gè)氨基酸殘

6、基。其中黃鱔Foxl3氨基酸序列與歐洲黑鱸（Dicentrarchus labrax）相似性最高，為82.9％。用最大似然法(ML)構(gòu)建了11個(gè)魚類Forkhead家族進(jìn)化發(fā)育樹，F(xiàn)orkhead家族3個(gè)成員分別聚類為3個(gè)分支(Foxl1，F(xiàn)oxl2和Foxl3)，黃鱔Foxl3氨基酸序列與斑馬魚(Danio rerio)、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、青鳉和歐洲黑鱸聚類為一支，與歐洲黑鱸親緣關(guān)系最近(bootstra

7、p89)。采用半定量和熒光定量PCR的方法分析了黃鱔foxl3基因的組織分布特征及在性腺中的表達(dá)差異，foxl3基因在黃鱔脾臟、腎臟、腦中表達(dá)量較高，血細(xì)胞和心臟中表達(dá)量較低;在黃鱔性腺發(fā)育的過(guò)程中foxl3的表達(dá)量逐漸增加，精巢中的表達(dá)量約為卵巢中的40倍，性腺中表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。在本研究中通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道了黃鱔miR-9而不是miR-430a結(jié)合于靶基因foxl33'UTR區(qū)域，推測(cè)黃鱔foxl3基因轉(zhuǎn)錄后可能受到