已烯雌酚對黑素合成的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、人類的皮膚和毛發(fā)顏色是結(jié)構(gòu)性著色和功能性著色的影響。結(jié)構(gòu)性著色是受遺傳基因控制的，不受外界環(huán)境的影響。而功能性著色的黑素合成水平則是在隨環(huán)境的變化而發(fā)生相應(yīng)的變化。
　　 目前研究認(rèn)為黑素生物合成的主要限速酶是酪氨酸酶家族成員。其中酪氨酸酶(Tyr)是一種與銅離子結(jié)合的糖蛋白，而酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2(TRP-2)是一種鐵和鋅結(jié)合糖蛋白。在皮膚黑素生物合成的過程中，酪氨酸羥化生成多巴，多巴氧化生成多巴醌，二羥基吲哚轉(zhuǎn)化成吲哚醌，這

2、些反應(yīng)步驟均需酪氨酸酶的的參與。酪氨酸酶缺乏或者活性改變時，以上反應(yīng)發(fā)生過程明顯變慢。因此酪氨酸酶活性的改變可能引起白癜風(fēng)的發(fā)病，而酪氨酸酶基因的突變也是白化病發(fā)病的重要原因之一。而TRP-1和TRP-2對黑素生成的數(shù)量和能力進(jìn)行進(jìn)一步的調(diào)控。TRP-1位于基因brown位點(diǎn)，TRP-2位于基因slaty位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的改變都可以引起皮膚顏色的改變。TRP-1、TRP-2與TYR在結(jié)構(gòu)上相似，并具有40％以上的同源氨基酸。由此推斷，三者

3、具有相同的原始基因，組成復(fù)合體在黑素合成過程中發(fā)揮作用。
　　 小眼畸形因子(MITF)是一個具HLHzip結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，近年來研究證實(shí)其在黑素細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中具有重要作用，被認(rèn)為是一個新的黑素合成調(diào)節(jié)因子。MITF能與高度保守的M-BOX序列結(jié)合，激活多種參與黑素合成的酶，如TYR、TRP-1、TRP-2轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，并且其自身的表達(dá)也同時受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。同時，關(guān)于黑素合成的信號通路研究也一直是黑素細(xì)胞生

4、物學(xué)作用的研究熱點(diǎn)之一。早期的研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶A(PKA)途徑和蛋白激酶C(PKC)途徑在黑素合成中發(fā)揮重要的作用。近年來，研究證實(shí)PKA的激活可以啟動MITF的轉(zhuǎn)錄活性，從而提高黑素的合成功能。這一作用可能機(jī)制是由于PKA途徑被激活后，CREB磷酸化水平增高，修飾MITF的啟動子而產(chǎn)生的。
　　 雌激素對皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑素細(xì)胞以及皮脂腺等附屬器的生理過程都有不同程度的調(diào)節(jié)作用，在皮膚老化、毛發(fā)生長、皮脂分泌甚至

5、皮膚癌的發(fā)病中都起到重要的作用。在黑素瘤細(xì)胞和痣細(xì)胞上都被證實(shí)有雌激素受體的表達(dá)。早期的研究證明已經(jīng)觀察到雌激素能引起人類皮膚色素沉著，臨床上也發(fā)現(xiàn)多例用性激素藥物治療白癜風(fēng)有效的報道。由于作為內(nèi)源性的生物活性物質(zhì)--雌二醇(estrogen)，極易氧化失活，而人工合成雌激素己烯雌酚(Diethylstilbe-strol)比天然雌激素更易于體內(nèi)的雌激素受體結(jié)合發(fā)揮作用，并具有雌二醇所有的藥理作用。因此我們選擇人工合成的雌激素--己烯雌

6、酚作為本課題研究藥物。
　　 本課題擬觀察己烯雌酚對黑色素瘤細(xì)胞黑素合成的影響，并進(jìn)一步探討其作用與cAMP-MITF-酪氨酸酶通路的關(guān)系。本課題分為以下三個部分：
　　 第一部分己烯雌酚對小鼠黑素瘤細(xì)胞B16黑素合成的影響。
　　 方法：選擇10-9μM、10-8μM、10-7μM、10-6μM、10-5μM、10-4μM、10-3μM濃度的己烯雌酚分別作用于黑素瘤細(xì)胞24h、48h、72h，用噻唑藍(lán)比色法(M

7、TT比色法)測定細(xì)胞的活性。然后，根據(jù)MTT結(jié)果，選取不同濃度的己烯雌酚作用于黑素瘤細(xì)胞，NaOH溶解法檢測其作用24h后黑素合成作用。同時選取其中一個濃度檢測藥物作用24h，48h，72h后黑素合成量。
　　 結(jié)果：己烯雌酚在10-8-10-3μM濃度促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞的增殖(p<0.01)。而這一作用在104μM時最為明顯，與10-3uM濃度組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。24h，48h，72h三個時間點(diǎn)，己烯雌酚對黑素瘤細(xì)

8、胞的促增殖作用無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。選取10-6μM、10-5μM、10-4μM、10-3μM濃度的己烯雌酚干預(yù)后，黑素合成檢測結(jié)果顯示，己烯雌酚對黑素合成有促進(jìn)作用，并呈濃度依賴。而24h，48h，72h三個時間點(diǎn)，10-3μM己烯雌酚對黑素合成的影響無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)
　　 結(jié)論：己烯雌酚對黑素合成有上調(diào)作用，并呈濃度依賴性。
　　 第二部分己烯雌酚促黑素合成作用涉及調(diào)節(jié)酪氨酸酶家族

9、　　 方法：用10-6μM、10-5μM、10-4μM、10-3μM四個濃度的己烯雌酚分別作用于黑素瘤細(xì)胞24h后，檢測其酪氨酸酶活性。同時應(yīng)用半定量RT-PCR和Western blot的方法，檢測不同濃度下己烯雌酚對TYR、TRP-1、TRP-2的mRNA轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：己烯雌酚對酪氨酸酶活性有上調(diào)作用并對三者的mRNA和蛋白水平都有不同程度的上調(diào)作用。
　　 結(jié)論：己烯雌酚促黑素合成可能與上調(diào)

10、酪氨酸酶表達(dá)、增加其活性有關(guān)。
　　 第三部分 cAMP-MITF通路參與己烯雌酚調(diào)節(jié)酪氨酸酶及黑素合成作用
　　 方法：不同濃度己烯雌酚干預(yù)后，用ELISA法檢測細(xì)胞內(nèi)cAMP的變化，RT-PCR和Western blot檢測MITFmRNA和蛋白水平的變化。然后用特異性的PKA抑制劑H891μM干預(yù)黑素瘤細(xì)胞1h，再用不同濃度的己烯雌酚作用于黑素瘤細(xì)胞24h，測定其黑素合成量、酪氨酸酶活性及其mRNA的變化以及MIT

11、F的mRNA水平的變化。
　　 結(jié)果：己烯雌酚對細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度和MITF的mRNA和蛋白水平都有上調(diào)作用。而在PKA途經(jīng)受到抑制的情況下，己烯雌酚促進(jìn)黑素合成、上調(diào)酪氨酸酶活性及mRNA的作用均受到抑制，同時其對MITF的上調(diào)作用也受到抑制。
　　 結(jié)論：提示己烯雌酚對黑素合成的作用可能通過cAMP/MITF/TYR途徑調(diào)控。
　　 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，己烯雌酚對黑素瘤細(xì)胞黑素合成有一定程度促進(jìn)作用，而這一作用