HIV-1感染者CD8+T細胞中Toll樣受體的表達及免疫功能研究.pdf

1、【背景】
　　獲得性免疫缺陷綜合征（acquiredimmunedeficiencysyndrome，AIDS），簡稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）引起的致命性慢性傳染病。研究顯示CD8+T細胞在控制HIV-1感染中起重要作用。它所介導(dǎo)的CTLs反應(yīng)是機體針對HIV-1感染最有力的效應(yīng)武器，但其具體機制尚未完全闡明。Toll樣受體（Toll-likereceptors，

2、TLRs）作為
　　聯(lián)系固有免疫與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的橋梁，可特異性的識別病原微生物，偶聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)特異性基因的表達和細胞因子/趨化因子的分泌，在機體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。已有研究提示TLRs與HIV-1感染密切相關(guān)。但HIV-1感染者CD8+T細胞與TLRs之間的關(guān)系尚未見報道。因此，本課題主要采用實時定量PCR（real-timePCR）法、流式細胞術(shù)及細胞內(nèi)因子染色（intracellularcytokiness

3、taining,ICS）等技術(shù)分析了31例HIV-1感染者和20例正常人CD8+T細胞中TLR4、TLR5和TLR7的表達，以篩選出表達異常的TLR，并探討其功能，從而為揭示HIV-1感染過程中TLR的作用、確定抗病毒藥物的研制靶點及提供新的疫苗候選分子打下堅實的實驗基礎(chǔ)。
　　【目的】
　　1.篩選HIV-1感染者CD8+T細胞中表達異常的TLR；2.研究TLR表達與CD4+T細胞計數(shù)、HIV-1病毒載量及HAART治療的

4、關(guān)系，探討其在HIV-1感染過程中的意義；3.研究TLR配體對CD8+T細胞的激活作用及CD8+T細胞分泌細胞因子的情況，以了解HIV-1感染過程中TLR的功能及輔助因
　　子在其中的作用。
　　【方法】
　　1.使用富集CD8+T細胞抗體混合物從人外周血中分離CD8+T細胞，采用實時定量PCR法篩選HIV-1感染者CD8+T細胞中表達異常的TLRmRNA，TLRmRNA的相對表達量通過2-△△Ct法計算，隨后采用流式

5、細胞術(shù)在蛋白水平驗證TLR的表達差異；2.采用流式細胞術(shù)和實時熒光定量PCR法檢測HIV-1感染者CD4+T細胞計數(shù)及病毒載量，通過統(tǒng)計學(xué)方法分析表達異常的TLR與CD4+T細胞計數(shù)、病毒載量及HAART治療的關(guān)系；3.采用密度梯度分離法從人外周血中分離PBMC，隨后通過流式細胞術(shù)檢測不同濃度的TLR7配體（0.5、1和5μg/ml）刺激6h后，純化CD8+T細胞和PBMC中CD8+T細胞表面CD69的表達；4.應(yīng)用細胞內(nèi)細胞因子染色技

6、術(shù)檢測不同濃度的TLR7配體（0.5、1和5μg/ml）刺激6h及20h后，純化CD8+T細胞和PBMC中CD8+T細胞分泌IL-2和IFN-γ的情況。
　　【結(jié)果】
　　1.實時定量PCR法檢測HIV-1感染者和正常人CD8+T細胞中TLR4、TLR5和TLR7的表達，結(jié)果顯示，HIV-1感染者CD8+T細胞中均有TLR4、TLR5和TLR7mRNA的表達，其中HIV-1感染者CD8+T細胞中TLR7mRNA的表達顯著升高

7、（P<0.05），而TLR4、TLR5mRNA的表達未見明顯變化（P>0.05）。為進一步證實TLR7的表達差異，采用流式細胞術(shù)檢測了HIV-1感染者和正常人CD8+T淋巴細胞中TLR7蛋白的表達，結(jié)果顯示HIV-1感染者CD8+T細胞中TLR7蛋白的表達亦顯著升高（P<0.05）。但HIV-1感染者CD8+T細胞上TLR7的表達與CD4+T細胞計數(shù)、病毒載量均無明顯相關(guān)性（P>0.05）。根據(jù)CD4+T細胞計數(shù)（>200cells/μ

8、l和<200cells/μl）、病毒載量（>105copies/ml和<105copies/ml）及有無接受HAART治療對HIV-1感染者進行分組，TLR7的表達亦無顯著差異（P>0.05）；
　　2.不同濃度（0.5、1和5μg/ml）的TLR7配體CL097刺激純化CD8+T細胞和PBMC6h后，用流式細胞術(shù)檢測CD8+T細胞表面CD69的表達水平，結(jié)果顯示HIV-1感染者和正常人純化CD8+T細胞表面CD69的表達均增高（

9、P<0.05），并且HIV-1感染者CD8+T細胞表面CD69的表達顯著高于其在正常人中的表達（P<0.05）。此外，HIV-1感染者PBMC中CD8+T細胞表面CD69的表達也顯著增高（P<0.05），但與純化的CD8+T細胞表面CD69的表達無顯著差異（P>0.05）。并且CD69在CD8+T細胞表面的表達呈濃度依賴性，CL097在濃度為0.5μg/ml時，CD8+T細胞表面CD69的表達最高；3.不同濃度（0.5、1和5μg/ml

10、）的TLR7配體刺激純化CD8+T細胞6h后，采用細胞內(nèi)細胞因子染色法檢測CD8+T細胞分泌IL-2和IFN-γ的情況。結(jié)果顯示HIV-1感染者和正常人CD8+T細胞均未產(chǎn)生IL-2和IFN-γ。延長孵育時間至20小時，仍未見IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生。不同濃度的TLR7配體（0.5、1和5μg/ml）刺激HIV-1感染者PBMC6小時后，用細胞內(nèi)細胞因子染色法檢測CD8+T細胞內(nèi)IL-2和IFN-γ的分泌情況，同樣未產(chǎn)生IL-2和IF

11、N-γ。延長孵育時間至20小時，發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞可產(chǎn)生IFN-γ（P<0.05），但未見IL-2的產(chǎn)生。此外，HIV-1感染者PBMC中CD8+T細胞IFN-γ的產(chǎn)生呈濃度依賴性，CL097在濃度為1μg/ml時，CD8+T細胞產(chǎn)生的IFN-γ最多。
　　【結(jié)論】
　　1.CD8+T細胞可表達TLR4、TLR5和TLR7。但HIV-1感染者CD8+T細胞中TLR7的表達顯著升高，提示HIV-1感染的發(fā)生、發(fā)展可能與TLR7

12、有一定關(guān)系；2.TLR7配體可顯著上調(diào)HIV-1感染者CD8+T細胞表面CD69的表達，但與PBMC中CD8+T細胞表面CD69的表達無顯著差異，提示TLR7信號與HIV-1感染過程中的免疫激活有一定關(guān)系，但不依賴于輔助因子的參與；3.ICS檢測發(fā)現(xiàn)TLR7配體雖不能刺激純化CD8+T細胞分泌細胞因子，但PBMC中的CD8+T細胞可在其誘導(dǎo)下產(chǎn)生IFN-γ，提示TLR7信號可誘生HIV-1感染者CD8+T細胞抗病毒分子的產(chǎn)生，但需要輔助