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文檔簡(jiǎn)介
1、【背景】
獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunedeficiencysyndrome,AIDS),簡(jiǎn)稱艾滋病,是由人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的致命性慢性傳染病。研究顯示CD8+T細(xì)胞在控制HIV-1感染中起重要作用。它所介導(dǎo)的CTLs反應(yīng)是機(jī)體針對(duì)HIV-1感染最有力的效應(yīng)武器,但其具體機(jī)制尚未完全闡明。Toll樣受體(Toll-likereceptors,
2、TLRs)作為
聯(lián)系固有免疫與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的橋梁,可特異性的識(shí)別病原微生物,偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從而誘導(dǎo)特異性基因的表達(dá)和細(xì)胞因子/趨化因子的分泌,在機(jī)體抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。已有研究提示TLRs與HIV-1感染密切相關(guān)。但HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞與TLRs之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。因此,本課題主要采用實(shí)時(shí)定量PCR(real-timePCR)法、流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞內(nèi)因子染色(intracellularcytokiness
3、taining,ICS)等技術(shù)分析了31例HIV-1感染者和20例正常人CD8+T細(xì)胞中TLR4、TLR5和TLR7的表達(dá),以篩選出表達(dá)異常的TLR,并探討其功能,從而為揭示HIV-1感染過(guò)程中TLR的作用、確定抗病毒藥物的研制靶點(diǎn)及提供新的疫苗候選分子打下堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【目的】
1.篩選HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中表達(dá)異常的TLR;2.研究TLR表達(dá)與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、HIV-1病毒載量及HAART治療的
4、關(guān)系,探討其在HIV-1感染過(guò)程中的意義;3.研究TLR配體對(duì)CD8+T細(xì)胞的激活作用及CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況,以了解HIV-1感染過(guò)程中TLR的功能及輔助因
子在其中的作用。
【方法】
1.使用富集CD8+T細(xì)胞抗體混合物從人外周血中分離CD8+T細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)定量PCR法篩選HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中表達(dá)異常的TLRmRNA,TLRmRNA的相對(duì)表達(dá)量通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算,隨后采用流式
5、細(xì)胞術(shù)在蛋白水平驗(yàn)證TLR的表達(dá)差異;2.采用流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HIV-1感染者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及病毒載量,通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析表達(dá)異常的TLR與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、病毒載量及HAART治療的關(guān)系;3.采用密度梯度分離法從人外周血中分離PBMC,隨后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的TLR7配體(0.5、1和5μg/ml)刺激6h后,純化CD8+T細(xì)胞和PBMC中CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá);4.應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技
6、術(shù)檢測(cè)不同濃度的TLR7配體(0.5、1和5μg/ml)刺激6h及20h后,純化CD8+T細(xì)胞和PBMC中CD8+T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的情況。
【結(jié)果】
1.實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)HIV-1感染者和正常人CD8+T細(xì)胞中TLR4、TLR5和TLR7的表達(dá),結(jié)果顯示,HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中均有TLR4、TLR5和TLR7mRNA的表達(dá),其中HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中TLR7mRNA的表達(dá)顯著升高
7、(P<0.05),而TLR4、TLR5mRNA的表達(dá)未見明顯變化(P>0.05)。為進(jìn)一步證實(shí)TLR7的表達(dá)差異,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了HIV-1感染者和正常人CD8+T淋巴細(xì)胞中TLR7蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中TLR7蛋白的表達(dá)亦顯著升高(P<0.05)。但HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞上TLR7的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)、病毒載量均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。根據(jù)CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)(>200cells/μ
8、l和<200cells/μl)、病毒載量(>105copies/ml和<105copies/ml)及有無(wú)接受HAART治療對(duì)HIV-1感染者進(jìn)行分組,TLR7的表達(dá)亦無(wú)顯著差異(P>0.05);
2.不同濃度(0.5、1和5μg/ml)的TLR7配體CL097刺激純化CD8+T細(xì)胞和PBMC6h后,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)水平,結(jié)果顯示HIV-1感染者和正常人純化CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)均增高(
9、P<0.05),并且HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)顯著高于其在正常人中的表達(dá)(P<0.05)。此外,HIV-1感染者PBMC中CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)也顯著增高(P<0.05),但與純化的CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。并且CD69在CD8+T細(xì)胞表面的表達(dá)呈濃度依賴性,CL097在濃度為0.5μg/ml時(shí),CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)最高;3.不同濃度(0.5、1和5μg/ml
10、)的TLR7配體刺激純化CD8+T細(xì)胞6h后,采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)CD8+T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的情況。結(jié)果顯示HIV-1感染者和正常人CD8+T細(xì)胞均未產(chǎn)生IL-2和IFN-γ。延長(zhǎng)孵育時(shí)間至20小時(shí),仍未見IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生。不同濃度的TLR7配體(0.5、1和5μg/ml)刺激HIV-1感染者PBMC6小時(shí)后,用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)CD8+T細(xì)胞內(nèi)IL-2和IFN-γ的分泌情況,同樣未產(chǎn)生IL-2和IF
11、N-γ。延長(zhǎng)孵育時(shí)間至20小時(shí),發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞可產(chǎn)生IFN-γ(P<0.05),但未見IL-2的產(chǎn)生。此外,HIV-1感染者PBMC中CD8+T細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生呈濃度依賴性,CL097在濃度為1μg/ml時(shí),CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ最多。
【結(jié)論】
1.CD8+T細(xì)胞可表達(dá)TLR4、TLR5和TLR7。但HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞中TLR7的表達(dá)顯著升高,提示HIV-1感染的發(fā)生、發(fā)展可能與TLR7
12、有一定關(guān)系;2.TLR7配體可顯著上調(diào)HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá),但與PBMC中CD8+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)無(wú)顯著差異,提示TLR7信號(hào)與HIV-1感染過(guò)程中的免疫激活有一定關(guān)系,但不依賴于輔助因子的參與;3.ICS檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TLR7配體雖不能刺激純化CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,但PBMC中的CD8+T細(xì)胞可在其誘導(dǎo)下產(chǎn)生IFN-γ,提示TLR7信號(hào)可誘生HIV-1感染者CD8+T細(xì)胞抗病毒分子的產(chǎn)生,但需要輔助
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