RGD-拖絲蛋白基因的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的分泌表達(dá).pdf

1、蜘蛛絲是自然界在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生的奇跡。蜘蛛絲柔韌性和彈性都很好，耐沖擊力也很強(qiáng)，無(wú)論是在干燥狀態(tài)或是潮濕狀態(tài)下都有很好的性能，是一種目前己知彈性和強(qiáng)度最高的天然蛋白質(zhì)纖維。蜘蛛絲特別是大囊狀腺分泌的拖絲，具有優(yōu)異的機(jī)械性能，已有大量的研究集中于此，目前對(duì)其結(jié)構(gòu)與性能已有深入的研究［1，2］。拖絲的抗拉伸強(qiáng)度可達(dá)1.3GPa，韌性達(dá)16×104J/Kg，勝過(guò)目前可得到的最好的幾種人工合成纖維，如用作防彈衣的Kevlar纖維［3，4］。

2、蜘蛛絲優(yōu)異的綜合性能吸引了世界各國(guó)的興趣，在紡織、國(guó)防軍事、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。由于蛛絲主要由蛋白質(zhì)組成，具有良好的生物可降解性和生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的外科手術(shù)縫合線、細(xì)胞和組織培養(yǎng)用的支持載體及藥物緩釋系統(tǒng)等方面有不可估量的應(yīng)用前景［5］。 本課題組在重組拖絲蛋白作為生物材料的研究方面進(jìn)行一系列的工作。目前已完成了棒絡(luò)新婦蛛拖絲蛋白全基因的克隆與測(cè)序［6，7］，設(shè)計(jì)與合成了含細(xì)胞粘附肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天

3、冬氨酸)的拖絲蛋白單體，實(shí)現(xiàn)了RGD-重組拖絲蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)［8］；建立了拖絲蛋白基因工程菌的高密度發(fā)酵和純化工藝，制備了規(guī)模量的重組拖絲蛋白［9］。同時(shí)，以獲得的重組拖絲蛋白作為生物材料，正在研究其組織相容性和細(xì)胞相容性［10］。然而，在大腸桿菌中表達(dá)的重組拖絲蛋白，易帶入內(nèi)毒素等污染物，而內(nèi)毒素的處理過(guò)程較為復(fù)雜，因此為了簡(jiǎn)化純化步驟，提高產(chǎn)品安全性，同時(shí)探索生產(chǎn)重組拖絲蛋白的新方法。本文在前人工作的基礎(chǔ)上，以畢赤酵母偏好的

4、密碼子，設(shè)計(jì)與合成了拖絲蛋白單體基因，體外構(gòu)建了拖絲蛋白多聚體基因，將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母細(xì)胞，最終實(shí)現(xiàn)了RGD-重組拖絲蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中的.。主要內(nèi)容及結(jié)果如下所示。 1.拖絲蛋白基因單體的合成與多聚化 1.1拖絲蛋白基因單體的設(shè)計(jì)與合成 以蜘蛛拖絲蛋白特征結(jié)構(gòu)單元為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)RGD-蛛絲蛋白單體，利用畢赤酵母偏好的密碼子合成拖絲蛋白基因單體。為了利于后續(xù)拖絲蛋白基因的表達(dá)，因此在設(shè)計(jì)過(guò)程中，要滿足以下要求：第一

5、、以畢赤酵母偏好的密碼子進(jìn)行合成；第二、拖絲蛋白單體富含甘氨酸與丙氨酸，這些重復(fù)的氨基酸不能僅由酵母利用頻率最高的那個(gè)密碼子編碼；第三、調(diào)整AT含量到一個(gè)合適的范圍之內(nèi)，防止連續(xù)AT序列的出現(xiàn)；第四、在蛛絲蛋白基因單體的末端，設(shè)計(jì)兩組的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(Cfr9，I\BspE I，EcoR/\Not I)，用于拖絲蛋白基因單體的克隆與多聚化。這樣得到的蛛絲蛋白基因單體由123個(gè)核苷酸組成，AT含量為38.2％。蛛絲蛋白基因單體，分成4條

6、寡核苷酸單鏈化學(xué)合成，通過(guò)磷酸化，互補(bǔ)退火，粘端連接而成。 1.2蛛絲蛋白基因單體的克隆與多聚化 克?。豪没騿误w末端的EcoR I與Not Ⅰ識(shí)別位點(diǎn)，進(jìn)行EcoR Ⅰ與Not Ⅰ雙酶解，與經(jīng)同樣酶解的克隆載體pBluescript SK Ⅱ連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dh5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含X-gal和IPTG的Amp平板藍(lán)白斑篩選，重組質(zhì)粒酶解鑒定后，挑取重組子進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確后，將重組子命名為pYNS-1。 多

7、聚化：利用基因單體上的同尾酶(Cfr9 Ⅰ\BspE Ⅰ)與克隆載體上的酶切位點(diǎn)Sca Ⅰ，分別進(jìn)行（Cfr9 Ⅰ+Sca Ⅰ）與（BspE Ⅰ+Sca Ⅰ)酶解，回收含蛛絲蛋白基因的片斷，Cfr9 Ⅰ與BspE Ⅰ是同尾酶，具有互補(bǔ)的粘性粘端(CCGG)，因此通過(guò)“頭尾相接”的方式，構(gòu)建蛛絲蛋白基因多聚體，依次構(gòu)建2聚體、4聚體、8聚體、16聚體以及32聚體重組拖絲蛋白基因工程菌，電泳鑒定，結(jié)果顯示：多聚體基因片斷的大小與理論值一致。

8、將上述所構(gòu)建多聚體，分別命名為pYNS-2、pYNS-4、pYNS-8、pYNS-16、pYNS-32。 2.畢赤酵母重組菌的構(gòu)建 將16聚體與32聚體拖絲蛋白基因進(jìn)行EcoR Ⅰ與Not Ⅰ雙酶解，克隆入經(jīng)同樣酶解的畢赤酵母穿梭型表達(dá)載體pPIC9K，分別構(gòu)建重組表達(dá)載體YNSR16與YNSR32。將以上重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，保存并大量擴(kuò)增。挑取克隆重組菌測(cè)序，測(cè)序正確之后，將YNSR16與YN

9、SR32線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主菌GS115，16聚體與32聚體拖絲蛋白基因，通過(guò)同源重組的方式整合入GS115基因組。通過(guò)不同濃度梯度的Y=PD-G418平板上，篩選多拷貝插入的重組菌。篩選出的重組菌，提取畢赤酵母基因組，通過(guò)上游引物α-factor與下游引物3’AOX，進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果顯示：16聚體重組菌PCR產(chǎn)物的大小約1800bp，32聚體重組菌PCR產(chǎn)物的大小約3450bp，與理論值一致，表明目的基因成功整合入畢赤

10、酵母基因組中，因此畢赤酵母重組菌的構(gòu)建在基因水平上達(dá)到預(yù)期目的。 3.RGD-重組拖絲蛋白的分泌表達(dá) 以16聚體與32聚體畢赤酵母重組菌為研究對(duì)象，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以SDS-PAGE分析，通過(guò)銀染顯色，結(jié)果顯示：16聚體畢赤酵母重組菌分泌表達(dá)重組拖絲蛋白，分子量為47 KD；而32聚體畢赤酵母重組菌沒(méi)有檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，摸索建立了搖瓶表達(dá)的方法，初步確定了誘導(dǎo)表達(dá)的條件：培養(yǎng)基為BMGY/BMMY，培

11、養(yǎng)基pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為30℃，誘導(dǎo)劑甲醇濃度為1.5％(V/V)；誘導(dǎo)時(shí)間為96 h。 4.影響RGD-重組拖絲蛋白表達(dá)的因素 本文以16聚體與32聚體畢赤酵母重組菌為對(duì)象，研究目的基因性質(zhì)與整合位點(diǎn)對(duì)重組拖絲蛋白表達(dá)的影響。16聚體與32聚體拖絲蛋白基因?yàn)楦叨戎貜?fù)性序列，GC含量較高，其mRNA易形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不利于mRNA與核糖體的結(jié)合，從而造成目的蛋白的表達(dá)水平不高，另外，拖絲蛋白多聚體基因富含甘氨酸

12、與丙氨酸密碼子，在翻譯過(guò)程中，造成宿主菌細(xì)胞內(nèi)的甘氨酰-tRNA與丙氨酰-tRNA的濃度無(wú)法滿足目的蛋白表達(dá)的需求，這兩個(gè)因素導(dǎo)致了重組拖絲蛋白的無(wú)法獲得高效表達(dá)。本文利用YNSR-16上的兩個(gè)線性化位點(diǎn)：Sal I與Sac I，將拖絲蛋白16聚體基因整合入宿主菌基因組。Sal I位點(diǎn)的線性化，使目的基因整合于畢赤酵母基因組的組氨酸脫氫酸(His4)基因位點(diǎn)處；Sac I的線性化，使目的基因整合于乙醇氧化酶(AOX)基因位點(diǎn)處。結(jié)果表明

13、：采用Sal I線性化YNSR-16整合基因組，利于重組拖絲蛋白的表達(dá)；而采用Sac I線性化YNSR-16與YNSR-32，整合基因組，發(fā)現(xiàn)重組拖絲蛋白的不表達(dá)，這可能與整合過(guò)程出錯(cuò)有關(guān)。 蜘蛛絲，特別是機(jī)械性能優(yōu)異的拖絲，作為高性能生物材料的研究已引起人們的關(guān)注。本室已在大腸桿菌系統(tǒng)中成功表達(dá)了含有細(xì)胞粘附肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的重組蜘蛛拖絲蛋白。本文在此基礎(chǔ)上，以畢赤酵母偏好的密碼子合成拖絲蛋白基因單體，同時(shí)

14、在單體序列的末端，設(shè)計(jì)了兩組限制性酶切位點(diǎn)，用于基因單體的克隆與多聚化。將基因單體克隆入載體pBluescript SK Ⅱ，測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。通過(guò)“頭尾相接”的策略構(gòu)建拖絲蛋白多聚體基因，依次構(gòu)建2聚體、4聚體、8聚體、16聚體以及32聚體RGD-重組拖絲蛋白基因工程菌。 選擇高聚合度的16聚體與32聚體拖絲蛋白基因，分別克隆到酵母穿梭型表達(dá)載體pPIC9K，重組表達(dá)載體命名為YNSR16與YNSR32。線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵

15、母宿主菌GS115，通過(guò)濃度梯度的YPD-G418平板，篩選多拷貝插入的重組菌。對(duì)篩選出的重組菌，通過(guò)引物(a-factor與3’AOX)進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示目的基因已正確整合入GS115基因組中。表明畢赤酵母重組菌的構(gòu)建在基因水平上達(dá)到預(yù)期目的。 以16聚體畢赤酵母重組菌的表達(dá)產(chǎn)物為分析對(duì)象，進(jìn)行SDS-PAGE分析，通過(guò)銀染顯色，結(jié)果顯示，16聚體畢赤酵母重組菌分泌表達(dá)分子量約47KD的RGD-重組拖絲蛋白，這與理論值相

16、符。在此基礎(chǔ)上，摸索建立了畢赤酵母重組菌搖瓶表達(dá)的方法，初步確定了誘導(dǎo)表達(dá)的條件：培養(yǎng)基pH值為6.0，培養(yǎng)溫度為30℃，誘導(dǎo)劑甲醇濃度為1.5％(V/V)；誘導(dǎo)時(shí)間為96h。 以16聚體與32聚體畢赤酵母重組菌為對(duì)象，研究了目的基因性質(zhì)與整合位點(diǎn)對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響。16聚體與32聚體拖絲蛋白基因?yàn)楦叨戎貜?fù)性序列，GC含量較高，其mRNA易形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)；此外，拖絲蛋白多聚體基因富含甘氨酸與丙氨酸密碼子，在翻譯過(guò)程中，造成